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武汉大学学报（医学版） 2019年第4期40卷 678-682页

作者：陈朝威马屹茕丁国华武汉大学人民医院肾内科

A激酶锚定蛋白(akaps)是一类结构不同、功能相关的激酶调节蛋白家族。akap1是其家族成员之一,主要锚定在线粒体外膜上,通过募集各种信号分子从而调控线粒体功能。越来越多的研究证据表明akap1在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、急性肺... 详细信息

A激酶锚定蛋白(akaps)是一类结构不同、功能相关的激酶调节蛋白家族。akap1是其家族成员之一,主要锚定在线粒体外膜上,通过募集各种信号分子从而调控线粒体功能。越来越多的研究证据表明akap1在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、急性肺损伤中发挥着重要作用。本文通过阐述akap1的生理功能,并对其在各种疾病发生发展的作用机制进展进行综述,为进一步研究提供基础和方向。

关键词： akap1 线粒体分裂肿瘤心血管疾病神经系统疾病急性肺损伤

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akap1在肥胖型糖尿病发生中的作用及初步机制研究

AKAP1在肥胖型糖尿病发生中的作用及初步机制研究

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作者：赵亚西安电子科技大学

学位级别：硕士

目的:线粒体被称为人体的“能量工厂”,在调节细胞糖、脂代谢中发挥关键作用。近期研究发现线粒体功能异常与糖尿病及其并发症的发生密切相关。A型激酶锚定蛋白1(akap1)定位于线粒体外膜,通过与蛋白或mRNA相互作用调控多种线粒体功能。... 详细信息

目的:线粒体被称为人体的“能量工厂”,在调节细胞糖、脂代谢中发挥关键作用。近期研究发现线粒体功能异常与糖尿病及其并发症的发生密切相关。A型激酶锚定蛋白1(akap1)定位于线粒体外膜,通过与蛋白或mRNA相互作用调控多种线粒体功能。体外研究发现线粒体akap1与脂质代谢相关,且akap1表达在脂肪细胞分化过程中显著增加,但akap1究竟在机体脂代谢中发挥何种作用,线粒体功能是否参与其中尚未可知。本研究拟利用akap1敲除小鼠,构建高脂饮食诱导的糖尿病模型,研究akap1在肥胖型糖尿病发生中的作用和具体机制。材料及方法:长期高脂饮食喂养野生型小鼠及akap1敲除小鼠,并且在喂养期间每两周检测一次小鼠的体重、空腹血糖。饲养24周后,利用双能X射线骨密度仪分析小鼠的体脂率,进行葡萄糖耐量、胰岛素耐量实验,并检测小鼠甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸水平,H&E染色观察小鼠脂肪及肝脏组织形态变化。进一步,为初步研究akap1影响肥胖型糖尿病发生的机制,我们采用代谢笼监测小鼠能量收支变化,利用自动化应用热像仪测定小鼠体温及肩胛棕色脂肪温度,并利用小动物直肠温度检测器测定小鼠直肠温度,利用Micro-PET/CT检测小鼠F-FDG葡萄糖摄取情况,又通过蛋白免疫印迹、实时定量PCR及免疫组织化学检测相关分子的表达情况,再通过透射电镜观察高脂饮食诱导的akap1敲除小鼠模型的各组织线粒体形态、数目及面积变化。最后,我们利用腺相关病毒恢复akap1敲除小鼠棕色脂肪组织中akap1的表达,并高脂喂养,检测小鼠体重、胰岛素敏感性及组织形态学改变。结果:我们发现,与野生型小鼠相比,akap1敲除可显著缓解高脂饮食诱导的糖尿病发生,具体表现为:(1)体重增长较慢;(2)体脂率较低;(3)血清中甘油三酯、胆固醇及游离脂肪酸含量更少;(4)改善高脂饮食诱导的脂肪肝。随后,利用代谢笼研究发现与野生型对照相比,akap1敲除小鼠食物摄入量无显著差异,但产热增加。进一步,我们发现敲除小鼠肩胛区体温升高,且急性冷刺激6h后敲除小鼠体温显著高于对照组,提示akap1敲除小鼠肩胛区棕色脂肪组织(BAT)产热增加。进一步研究发现寒冷刺激下akap1敲除小鼠BAT的F-FDG葡萄糖摄取能力增强,提示其代谢活性增强。此外,免疫组化和Western Blot结果均显示akap1敲除小鼠BAT中UCP1表达显著增多。上述结果提示akap1敲除小鼠BAT产热活性增加。最后,我们利用腺相关病毒恢复敲除小鼠BAT组织的akap1表达,发现高脂饮食饲养六个月后,与注射对照病毒的akap1敲除小鼠相比,恢复棕色脂肪组织中akap1表达后小鼠体重增加,发生胰岛素抵抗,且全身产热减少,提示akap1可通过抑制棕色脂肪组织线粒体产热促进高脂饮食诱导的肥胖及糖尿病发生。结论:在本研究中,我们利用akap1敲除小鼠构建高脂饮食诱导的糖尿病模型,研究akap1在肥胖型糖尿病发生中的作用,并初步探讨其机制。我们发现,akap1敲除可以抑制高脂饮食诱导的肥胖,改善高脂饮食诱导的代谢紊乱、血糖异常变化以及血脂增高。进一步,我们发现akap1敲除小鼠BAT线粒体UCP1表达增多,且产热活性增加。最后,恢复akap1敲除小鼠BAT中akap1表达可逆转上述效应,提示akap1可通过抑制BAT线粒体产热促进高脂饮食诱导的肥胖型糖尿病发生。

关键词： akap1 肥胖型糖尿病高脂饮食 akap1敲除小鼠模型 BAT

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akap1抑制棕色脂肪细胞线粒体产热的作用及机制研究

AKAP1抑制棕色脂肪细胞线粒体产热的作用及机制研究

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作者：何元方延安大学

学位级别：硕士

目的:明确A型激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,akap1)在棕色脂肪细胞线粒体产热中发挥的作用;探讨akap1调节棕色脂肪细胞线粒体产热的作用机制;初步探讨akap1在高糖高脂环境中表达下调的机制。方法:(1)akap1促进棕色脂肪细... 详细信息

目的:明确A型激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,akap1)在棕色脂肪细胞线粒体产热中发挥的作用;探讨akap1调节棕色脂肪细胞线粒体产热的作用机制;初步探讨akap1在高糖高脂环境中表达下调的机制。方法:(1)akap1促进棕色脂肪细胞线粒体产热的作用研究:利用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测高脂喂养下akap1敲除小鼠和野生型小鼠棕色脂肪组织线粒体的氧耗速率,并通过WB实验对高脂喂养的akap1敲除小鼠和野生型小鼠棕色脂肪组织UCP1表达进行检测;通过不同浓度棕榈酸诱导原代棕色脂肪细胞肥大模型,采用油红染色及BODIPY染色实验检测棕榈酸处理下原代棕色脂肪细胞中脂滴的形态变化,并使用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测高浓度棕榈酸处理下akap1敲除小鼠和野生型小鼠原代棕色脂肪细胞的氧耗速率。(2)akap1促进棕色脂肪细胞线粒体产热的机制研究:利用CO-IP-MS鉴定与akap1相互作用的分子,并采用Western blot实验进行验证;利用免疫荧光实验检测akap1与ACSL1在线粒体上的定位;采用Seahorse细胞能量代谢检测仪检测干涉ACSL1对高浓度棕榈酸处理的akap1敲除小鼠和野生型小鼠原代棕色脂肪细胞氧耗速率的影响。(3)肥胖可反馈性抑制akap1表达的初步机制研究:采用WB及Q-PCR实验对肥胖小鼠不同组织中akap1的表达水平进行检测,并验证高浓度的棕榈酸是否影响akap1的表达,通过生物信息学方法对影响akap1表达的转录因子进行预测,使用WB及Q-PCR实验检测在干涉CEBP-β后野生型小鼠原代棕色脂肪细胞中akap1的表达,并利用GEO数据库分析akap1与CEBP-β的相关性。结果:(1)研究发现,与野生型小鼠相比,高脂喂养的akap1敲除小鼠棕色脂肪组织的线粒体氧耗显著增强(P1表达增多,表明高脂喂养条件下akap1敲除小鼠线粒体产热增强。然而,正常饮食条件下,与野生型小鼠相比,akap1敲除小鼠UCP1表达水平并未改变,提示akap1并不直接影响UCP1表达变化。利用棕榈酸诱导为原代棕色脂肪细胞提供高脂环境,从而构建小鼠原代棕色脂肪细胞肥大模型,发现在高浓度棕榈酸处理后,与野生型小鼠相比,akap1敲除小鼠的原代棕色脂肪细胞脂滴含量减少;进一步,发现通过高浓度棕榈酸处理的akap1敲除小鼠原代棕色脂肪细胞基础氧耗速率(P1)、解偶联呼吸(Pakap1可抑制线粒体呼吸功能。(2)利用CO-IP-MS分析发现ACSL1与akap1相互作用,且两者均定位在线粒体上。尽管akap1敲除并不影响ACSL1的线粒体定位,然而,akap1敲除后线粒体ACSL活性显著增强(Pakap1可显著降低PKA活性(P1的表达可抑制akap1敲除的棕色脂肪细胞线粒体氧耗。(3)在肥胖小鼠的脂肪组织中akap1的表达水平较正常小鼠显著降低(Pakap1的表达水平较对照组显著降低(Pakap1的转录调控因子为CEBP-β。下调棕色脂肪细胞中CEBP-β可显著抑制akap1的表达(Pakap1和CEBP-βmRNA表达水平呈显著正相关(P=0.0025,P=0.0004)。结论:在本研究中,利用棕榈酸诱导构建原代棕色脂肪细胞肥大模型,研究akap1在棕色脂肪细胞线粒体功能中发挥的作用,并初步探讨其作用机制。研究发现:(1)高脂条件下akap1敲除增强棕色脂肪细胞线粒体氧耗能力。(2)akap1可能通过抑制ACSL1活性进而抑制棕色脂肪细胞的线粒体呼吸。(3)高脂状态下小鼠脂肪组织中akap1表达降低,其机制可能与转录因子CEBP-β表达正相关。

关键词： akap1 棕色脂肪细胞线粒体产热功能棕榈酸

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线粒体akap1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究

线粒体AKAP1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究

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作者：亓秉超中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:2019年,国际糖尿病联盟发布的第9版《糖尿病地图》显示,中国糖尿病患病率居世界前列。糖尿病患病人数居世界第一位,约1.16亿。心血管并发症是糖尿病最常见的并发症。据统计,约50%糖尿病患者死于心血管并发症。心脏是一个高能... 详细信息

研究背景:2019年,国际糖尿病联盟发布的第9版《糖尿病地图》显示,中国糖尿病患病率居世界前列。糖尿病患病人数居世界第一位,约1.16亿。心血管并发症是糖尿病最常见的并发症。据统计,约50%糖尿病患者死于心血管并发症。心脏是一个高能量需求器官,线粒体是心肌细胞中最主要的产能细胞器。绝大多数ATP通过线粒体氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)产生。线粒体作为心肌细胞ATP的主要提供者和ROS的主要来源,与糖尿病心肌病的发生发展密切相关。糖尿病心肌病主要特征是线粒体功能障碍和氧化应激。然而,糖尿病心肌病线粒体功能障碍和氧化应激的具体机制仍未阐明。A激酶锚定蛋白是一类功能相似的蛋白家族,其主要功能是将c AMP依赖性蛋白激酶A招募到特定的亚细胞结构。A激酶锚定蛋白121(A-kinase anchoring protein 121,akap1)定位于线粒体外膜,是线粒体呼吸的重要调节因子。既往研究发现akap1在缺血心肌中发生泛素化降解,进而导致线粒体自噬过度增加,加重心肌缺血损伤。上述证据强烈提示akap1具有心肌保护作用。然而,akap1在糖尿病心肌病中的作用及分子机制未见报道。我们预实验结果显示,链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠心肌akap1表达显著降低,提示akap1可能参与糖尿病心肌病的发生发展。基于此,本研究利用已构建的akap1敲除小鼠和原代乳鼠心肌细胞,从整体动物和细胞水平探讨akap1在糖尿病心肌病中的作用并阐明其具体机制,为糖尿病心肌病的防治提供新的思路。研究目的:1.探究akap1是否参与糖尿病心肌病的发生发展过程。2.阐明akap1影响糖尿病心肌病发生发展的分子机制。研究方法:第一部分:akap1敲除加重糖尿病诱导的心脏功能障碍给予8周龄akap1基因敲除小鼠及其同窝野生型小鼠腹腔注射STZ,构建糖尿病小鼠模型。对照组注射柠檬酸缓冲液。所有同基因型小鼠随机分配,共分为四组:野生型组(WT),akap1敲除组(KO),糖尿病组(DM),akap1敲除糖尿病组(KO/DM)。造模后小鼠继续饲养12周,并定期检测小鼠血糖和体重。分别在造模后6周和12周检测WT组和DM组小鼠心肌中akap1表达情况。12周后,超声心动图检测所有小鼠心功能;Millar导管检测小鼠血流动力学变化;Masson染色法观察分析心肌纤维化程度。第二部分:akap1敲除加重糖尿病小鼠心肌线粒体功能障碍和细胞凋亡取新鲜小鼠心脏,制作组织学样本。透射电镜观察分析小鼠心肌线粒体形态特点;Mito SOX染色并在共聚焦显微镜下观察分析线粒体ROS水平;TUNEL染色法观察分析心肌细胞凋亡情况。细胞实验方面,分离并培养SD大鼠乳鼠(1-2天)原代心肌细胞,敲低akap1后继续高糖(33 mmol/L葡萄糖)培养48小时。JC-1染色检测分析线粒体膜电位变化;Seahorse检测分析线粒体呼吸功能相关指标;Annexin V-FITC/PI染色分析原代心肌细胞凋亡情况。第三部分:akap1敲除可抑制NADH-泛醌氧化还原酶75 k Da亚基(NADHubiquinone oxidoreductase 75 k Da subunit,NDUFS1)的线粒体定位进而抑制线粒体复合体Ⅰ活性免疫共沉淀法捕获akap1互作蛋白,银染后切取差异条带,质谱分析akap1互作蛋白。免疫荧光法共定位akap1及互作蛋白;Mito Tracker染色标记线粒体;利用小干扰RNA分别敲低akap1及其互作蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况。线粒体复合体Ⅰ活性检测试剂盒分析复合体Ⅰ活性。第四部分:上调akap1可促进NDUFS1的线粒体定位进而缓解糖尿病心肌损伤心肌点注射含有akap1过表达的腺相关病毒(AAV9-akap1)及其对照病毒(AAV9-GFP),构造糖尿病小鼠模型,共分为四组:糖尿病组(DM/AAV9-GFP),akap1敲除糖尿病组(KO/DM/AAV9-GFP),糖尿病过表达组(DM/AAV9-akap1),akap1敲除糖尿病过表达组(KO/DM/AAV9-akap1)。喂养12周后,超声检测小鼠心功能;Millar导管检测小鼠血流动力学变化;透射电镜观察分析小鼠心肌线粒体形态特点;Seahorse检测分析线粒体呼吸功能相关指标;TUNEL染色法观察并分析心肌细胞凋亡情况。另外,培养原代心肌细胞进一步验证其分子机制。研究结果:第一部分:akap1敲除加重糖尿病诱导的心脏功能障碍Western blotting显示,造模6周后,与WT组相比,DM组小鼠心肌akap1表达水平显著下降,造模12周后下降更明显。q PCR和免疫组化也证实了同样的结果。超声结果显示,与WT

关键词： akap1 NDUFS1 糖尿病心肌病细胞凋亡线粒体功能

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