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ajap1通过β-catenin参与OSAS大鼠认知障碍的研究

AJAP1通过β-catenin参与OSAS大鼠认知障碍的研究

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作者：刘晓昱遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过建立慢性间接性缺氧模型,使用ajap1过表达慢病毒和β-catenin抑制剂MSAB进行调节,观察OSAS大鼠海马中ajap1与β-catenin的相互作用及ajap1介导β-catenin参与其认知障碍机制的研究。方法:随机将60只成年雄性SD大鼠分为6组:正... 详细信息

目的:通过建立慢性间接性缺氧模型,使用ajap1过表达慢病毒和β-catenin抑制剂MSAB进行调节,观察OSAS大鼠海马中ajap1与β-catenin的相互作用及ajap1介导β-catenin参与其认知障碍机制的研究。方法:随机将60只成年雄性SD大鼠分为6组:正常组（CON组）、OSAS模型组（OSAS组）、ajap1基因慢病毒过表达组（ajap1+组）、空病毒对照组（Vehicle组）、ajap1基因慢病毒过表达+β-catenin抑制剂组（ajap1+/MSAB组）、空病毒对照+二甲亚砜对照组（Vehicle/DMSO组）。使用双侧海马立体定位注射方法将ajap1过表达慢病毒和对照空病毒注射入雄性SD大鼠海马CA1区,14天后,采用免疫印迹及免疫荧光技术检测海马慢病毒转染率;慢病毒转染成功后,除了正常组外的其余5组大鼠均建立OSAS模型。ajap1+/MSAB组和Vehicle/DMSO组在造模期间先分别腹腔注射MSAB、DMSO进行干预。通过Morris水迷宫实验观测和评价各组大鼠的行为研究变化;Hoechst染色观察各组大鼠海马神经元的凋亡情况;采用免疫共沉淀（CO-IP）观察ajap1与β-catenin的相互作用情况;通过免疫荧光观察ajap1和c-Myc蛋白的神经元定位,WB方法检测ajap1、β-catenin和c-Myc蛋白的表达水平变化情况。结果:1.慢病毒转染:双侧海马立体定位注射ajap1过表达慢病毒14天后,使用免疫荧光技术观察到大鼠海马区有明显的阳性表达。通过WB技术检测发现与对照组相比,大鼠海马组织中ajap1表达水平升高,存在差异（P＜0.05）。2.通过对比每只大鼠在缺氧及复氧期间的鼠尾动脉血氧饱和度,结果发现两者有差异（P＜0.05）,缺氧期间（64.52±2.57）%,复氧期间（95.43±1.60）%,且经历过造模的大鼠表现为嗜睡、烦躁、精神萎靡、呼吸急促、深大呼吸等症状,说明OSAS模型建立成功。***水迷宫测试:与CON组大鼠相比,OSAS组寻找隐藏平台的时间更长,探索实验穿过平台的次数较少（P＜0.05）;ajap1+组与OSAS组、Vehicle组相比,寻找隐藏平台的时间较少,探索实验穿过平台的次数更多（P＜0.05）;OSAS组与Vehicle组大鼠寻找隐藏平台的时间和穿过平台的次数无明显差异（P＞0.05）。与ajap1+组大鼠相比,ajap1+/MSAB组寻找隐藏平台的时间更长,探索实验穿过平台的次数较少（P＜0.05）;Vehicle/DMSO组大鼠比ajap1+/MSAB组寻找隐藏平台的时间延长,探索实验穿过平台的次数减少（P＜0.05）。4.免疫荧光:ajap1和c-Myc蛋白均主要表达在神经元细胞的胞膜上***染色:OSAS组比CON组、ajap1+组的神经元细胞凋亡数量增多,凋亡情况严重。与ajap1+/MSAB组、Vehicle组相比,ajap1+组的神经元细胞凋亡数量较少,凋亡情况不明显。6.免疫共沉淀（CO-IP）:在OSAS组海马组织中,ajap1蛋白与β-catenin蛋白可以相互作用,相互影响。*** blot:与CON组相比,OSAS组大鼠海马组织中ajap1蛋白含量降低,但β-catenin和c-Myc蛋白含量升高（P＜0.05）;OSAS组与Vehicle组中ajap1、β-catenin和c-Myc蛋白含量均无明显差异（P＞0.05）。与ajap1+/MSAB组相比,ajap1+组大鼠海马组织中c-Myc蛋白浓度明显降低（P＜0.05）,但ajap1和β-catenin蛋白含量无明显差异（P＞0.05）,Vehicle/DMSO组ajap1蛋白含量降低（P＜0.05）,β-catenin蛋白含量升高（P＜0.05）,而c-Myc蛋白含量无明显差异（P＞0.05）。结论:ajap1可通过与β-catenin相互作用抑制了β-catenin的活性并降低了β-catenin蛋白的表达,进一步降低了其下游靶标c-Myc的表达水平,减少细胞凋亡,从而改善了OSAS大鼠的认知功能。

关键词：阻塞性睡眠呼吸暂停综合征慢性间歇性缺氧 ajap1 β-catenin 认知功能

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ajap1在脑胶质瘤中异常表达及抑制细胞增殖与侵袭的分子机制研究

AJAP1在脑胶质瘤中异常表达及抑制细胞增殖与侵袭的分子机制研究

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作者：叶敏华南昌大学

学位级别：硕士

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，其中2/3以上为恶性胶质瘤，占成人全身肿瘤约2%，胶质母细胞瘤中位生存期仅1年，5年的生存期几乎为零[1-2]。手术切除，术后化疗和放疗综合疗效仍不是很理想，目前尚无根治方法。脑胶质瘤侵袭性生长... 详细信息

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，其中2/3以上为恶性胶质瘤，占成人全身肿瘤约2%，胶质母细胞瘤中位生存期仅1年，5年的生存期几乎为零[1-2]。手术切除，术后化疗和放疗综合疗效仍不是很理想，目前尚无根治方法。脑胶质瘤侵袭性生长的特性是胶质瘤难以根治和复发的根本原因。因此胶质瘤治疗策略的优化不仅应着眼在原发部位肿瘤的治疗，还应着力控制肿瘤细胞向正常脑组织的侵袭和转移。寻找具有抑制胶质瘤细胞侵袭、转移特性的相关基因，深入揭示其作用机制，对胶质瘤治疗具有重要意义。越来越多的证据表明在人类染色体1p36区域编码着许多类似肿瘤抑制基因[3-4]。最近研究报告发现粘附连接相关蛋白-1(Adherens Junctional AssociatedProtein-1，ajap1,也称为Shrew-1)作为另一个类似抑癌基因定位于人类染色体1p36区域。Radlwimmer研究组对胶质母细胞瘤患者进行基因组杂交和微阵列分析比较，ajap1首先被描述为一种与胶质母细胞发生的生物标记物[5]。随后,Zhang课题组证实在SVHVC, LOVO, SW480,MCF-7等多种细胞系中，ajap1启动子区存在着高度甲基化[6]。但是，在胶质瘤细胞中改变ajap1的表达水平影响细胞侵袭和增殖的机制仍然不清楚。本课题重点研究ajap1在胶质瘤中的异常表达情况，探讨其与胶质瘤级别之间的关系，应用ajap1重组腺病毒转染技术改变胶质瘤细胞中ajap1的表达水平，初步探讨研究ajap1对胶质瘤生物学表型的影响及其潜在机制。方法第一部分应用免疫组织化学染色以及免疫荧光共聚焦成像方法检测48例胶质瘤标本、5例正常脑组织标本中ajap1的表达水平，采用Western blot方法对8个胶质瘤细胞系、1个正常细胞系HEK293中ajap1蛋白表达水平进行检测，初步研究分析ajap1与胶质瘤级别之间的关系。第二部分侧重于研究人脑胶质瘤细胞转染ajap1重组腺病毒后对胶质瘤细胞恶性生物学表型及对细胞骨架影响的体外研究，并初步探讨其潜在机制。U87、U251细胞转染ajap1重组腺病毒质粒后，Transewell实验检测胶质瘤细胞侵袭能力的改变;平板克隆形成试验检测细胞的增殖能力;划痕实验评价细胞迁移能力。Western blot方法检测胶质瘤细胞增殖、侵袭等相关指标的变化，同时应用免疫荧光方法检测过表达ajap1后对细胞骨架的变化。第三部分则利用颅脑立体定向技术将同时转染ajap1重组腺病毒和荧光素酶慢病毒的U87胶质瘤细胞接种在5周大小的BALB/c-nu（SPF）雌性裸鼠尾状核建立颅内胶质瘤模型，设空白对照组，利用活体生物发光成像系统（IVISLumina Imaging System）动态观察肿瘤生长情况及裸鼠的生存期的改变，应用组织病理学方法检测两组动物肿瘤标本中增殖、侵袭等蛋白表达水平的变化。结果通过免疫组化对石蜡切片检测显示：胶质瘤样本中ajap1的表达水平显著低于正常脑组织，并且随着胶质瘤级别的增高，ajap1的表达随着降低。组织免疫荧光试验也同样证实在高级别的胶质瘤标本中，ajap1的表达明显低于低级别胶质瘤标本，与免疫组化结果相符，ajap1定位于胞浆。因此ajap1的表达水平与胶质瘤病理分级呈负相关。在胶质瘤细胞系中，Western blot检测显示在人胚肾上皮细胞HEK293中呈高表达，而在大部分胶质瘤细胞系中显著低表达，以A172、TJ905、TJ899低表达最为显著。随后，利用ajap1重组腺病毒转染U87、U251胶质瘤细胞，通过提高细胞中ajap1的蛋白表达水平，ajap1组与空白对照组及转染空载体vector组相比较，平板克隆形成试验显示ajap1组肿瘤细胞的克隆数形成减低，transwell试验显示ajap1组细胞的侵袭能力受到明显抑制，划痕试验显示细胞的迁移能力下降，Western Blot检测Ki-67、MMP-9蛋白的表达水平均有明显的下调。在细胞免疫荧光试验中，过表达ajap1后，U87、U251细胞骨架结构发生改变，ajap1组与vector组相比较，细胞生长模式发生改变，由原来的球状聚集生长形态变为片状生长，丝状伪足明显减少。在体内动物实验中，活体动物生物荧光成像结果证实U87-ajap1组成瘤明显小于U87-vector组，且vector组于32d内全部死亡，ajap1组32d内仅死亡4只。免疫组化结果表明ajap1的表达明显上调，而Ki-67、MMP-9的表达明显下调，与细胞实验结果相符。结论 1.以正常脑组织做对照，ajap1基因在胶质瘤标本和恶性胶质瘤细胞系中存在低表达，与肿瘤级别呈负相关，提示ajap1可能作为抑癌基因参与胶质瘤的发生与发展。 2.应用ajap1重组腺病毒载体转染人脑胶质瘤U87和U

关键词：胶质瘤 ajap1 增殖侵袭迁移细胞骨架

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胶质瘤中EGFR/EGFRvⅢ下调抑癌基因ajap1表达的机制研究

胶质瘤中EGFR/EGFRvⅢ下调抑癌基因AJAP1表达的机制研究

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作者：杨超天津医科大学

学位级别：硕士

目的:利用TCGA、Rambrant、CGGA三大数据库的信息学分析发现EGFR和ajap1负性相关,尤其在四亚型分型(Classical,Mesenchymal,Neural,and Proneural)中存在EGFR扩增和突变的Classical亚型。结合EGFRv Ⅲ(EGFR突变持续激活)慢病毒系统和小分子阻断剂,我们验证并证实恶性胶质瘤通过EGFR通路抑制抑癌基因ajap1表达,从而增强其边缘侵袭能力,并且在体内和体外试验中验证MK2206可以有效阻断EGFRvⅢ下游通路活性,为EGFR扩增和EGFRvⅢ阳性恶性胶质瘤化疗提供新的方案。方法:1.生物信息学分析EGFR和ajap1在不同临床样本数据库(TCGA、CGGA和Ranmbrant)中基因拷贝数、mRNA、蛋白水平的高低;利用含EGFRv Ⅲ表达载体的慢病毒转染U87和LN229,模拟胶质瘤细胞系中EGFR通路持续激活状态,在体外试验中验证EGFR通路激活对抑癌基因ajap1转录表达的调控。2.用表达EGFRvⅢ突变体的慢病毒感染胶质瘤细胞系U87和LN229,Real-time PCR验证ajap1 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹方法检测EGFR、EGFRvⅢ、p-EGFR、AKT、p-AKT、ajap1的表达水平变化;免疫荧光染色检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞骨架和细胞形态的改变;Transwell实验检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞迁移能力的影响。3.针对性选择课题预测的功能信号通路EGFR/EGFRvⅢ-PI3K-AKT-EZH2上不同节点的小分子抑制剂:LY294002(PI3K抑制剂)、MK2206(P-AKT抑制剂)、DZNEP(组蛋白三甲基化抑制剂),节段阻滞通路活性并观察ajap1 mRNA和蛋白表达变化,观察通路阻滞后细胞骨架和形态改变是否恢复。4.通过生物信息学分析预测H3K27Me3在ajap1启动子区域结合位点,针对性设计Chip-PCR找出对照组、EGFR通路持续激活组和通路激活后治疗组(挑选P-AKT小分子抑制剂)三组处理后H3K27Me3在ajap1启动子区结合量的变化。5.构建胶质瘤EGFR/EGFRvⅢ颅内动物模型,研究P-AKT小分子抑制剂MK2206在颅内对EGFR/EGFRvⅢ下游AKT磷酸化的影响,体内实验验证阻断EGFR/EGFRvⅢ-PI3K-AKT-EZH2后ajap1表达量变化和肿瘤边缘侵袭情况。结果:1.信息学分析显示EGFR和ajap1在基因拷贝数上没有明显相关,但是在mRNA水平存在明显负相关;在TCGA、CGGA和Ranmbrandt三个数据库中EGFR富集的classcial亚型中,ajap1和EGFR存在明显负相关,提示EGFR和ajap1存在转录前调控关系。2.转染EGFRvⅢ病毒的胶质瘤细胞中EGFRv Ⅲ、p-EGFR和p-AKT表达明显上调,并且ajap1表达水平明显下降;共聚焦显微镜成像显示过表达EGFRvⅢ后胶质瘤细胞ajap1表达降低,且F-actin染色显示丝状伪足增多和板状伪足减少;Transwell实验显示EGFRvⅢ过表达后细胞迁移能力明显增强。3.胶质瘤细胞系过表达ajap1后出现丝状伪足减少和板状伪足增多。4.在过表达EGFRvⅢ的胶质瘤细胞系中,梯度浓度使用PI3K抑制剂(LY294002)、p-AKT抑制剂(MK2206)和组蛋白三甲基化抑制剂(DZNEP)后ajap1蛋白表达量上升;共聚焦显微镜成像显示过表达EGFRv Ⅲ组经过p-AKT抑制剂处理后ajap1表达上调,且出现丝状伪足减少和板状伪足增多。5.免疫荧光染色显示EGFRvⅢ过表达后细胞核中H3K27Me3上调,P-AKT抑制剂MK2206处理后H3K27Me3表达下调;在核蛋白免疫印迹试验中出现同样的结果。***-PCR实验显示过表达EGFRv Ⅲ后H3K27Me3在ajap1启动子区结合量增加,p-AKT抑制剂MK2206处理后结合量下降。7.87-Vector/87-EGFRv Ⅲ混合胶质瘤颅内模型证实P-AKT抑制剂能成功阻断EGFR/EGFRv Ⅲ下游AKT的磷酸化并上调ajap1表达量,HE染色显示治疗组正常组织和肿瘤边界相对于对照组更加清晰。结论:***/EGFRvⅢ信号通路激活可以改变胶质瘤细胞骨架结构,增加胶质瘤迁移能力。2.p-AKT、EZH2在过表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞系中参与下调ajap1。3.体内外研究显示阻断EGFR/EGFRvⅢ-AKT-EZH2可以上调ajap1表达。***/EGFRv Ⅲ通过p-AKT/EZH2信号传导通路上调ajap1启动子区H3K27Me3结合量,从而下调ajap1表达。5.p-AKT小分子抑制剂MK2206对EGFR/EGF

关键词：胶质母细胞瘤 EGFR/EGFRvⅢ p-AKT ajap1 细胞骨架侵袭

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作者：刘聪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:通过对EGFR和ajap1在胶质瘤中的相关性及EGFR对人胶质瘤细胞细胞骨架及侵袭迁移能力影响的研究,探讨EGFR在胶质瘤发展中的新机理及对预后的影响。方法:免疫组化及免疫荧光检测65例胶质瘤标本和10例正常脑组织中ajap1和EGFR的表达;... 详细信息

目的:通过对EGFR和ajap1在胶质瘤中的相关性及EGFR对人胶质瘤细胞细胞骨架及侵袭迁移能力影响的研究,探讨EGFR在胶质瘤发展中的新机理及对预后的影响。方法:免疫组化及免疫荧光检测65例胶质瘤标本和10例正常脑组织中ajap1和EGFR的表达;细胞免疫荧光检测ajap1在U87和U87-VⅢ(EGFRVⅢ表达载体的慢病毒转染人胶质瘤U87细胞)中的表达;对65位胶质瘤患者行电话随访,详细记录术后放化疗、KPS评分、复发和死亡等情况,随访资料整理后做生存曲线分析。鬼笔环肽检测U87-VⅢ细胞骨架的改变;Western Blot检测U87-VⅢ中EGFR及增殖和侵袭相关指标的变化;划痕实验评价U87-VⅢ的迁移能力;Transwell实验检测U87-VⅢ细胞侵袭能力的改变。结果:免疫组化与免疫荧光结果均显示ajap1在正常脑组织中的表达要高于低级别胶质瘤,随着胶质瘤级别的升高,ajap1的表达降低,而EGFR的表达则与之相反,胶质瘤级别越高,EGFR的表达越高;细胞免疫荧光显示ajap1在U87和U87-VⅢ中表达均低,在U87-VⅢ中表达更低,pajap阳性率明显低于低级别组(30.77%VS57.69%,p15%,pajap1与EGFR表达相关性分析提示ajap1与EGFR的表达呈中度负相关(p1,r=-0.535),差异具有统计学意义;ajap1/EGFR在高低级别胶质瘤中的阳性表达程度分析显示低级别组ajap1的阳性表达程度高于高级别组,pajap1,EGFR的表达无明显相关性,p>0.05,差异无统计学意义;生存分析提示ajap1和EGFR阳性/阴性组OS和PFS比较无统计学差异,但ajap1阳性生存率高于阴性,EGFR阳性生存率低于阴性。鬼笔环肽细胞骨架染色显示U87-VⅢ组与U87组相比细胞骨架结构发生改变,细胞的丝状伪足增多,板状伪足减少;Western Blot显示EGFR、Ki-67、MMP-9蛋白在U87-VIII的表达水平较U87和U87-Vector均有明显的升高;Transwell试验显示U87-VⅢ组细胞的侵袭能力明显增强;划痕试验显示U87-VⅢ组细胞的迀移能力增强。结论:在胶质瘤中ajap1与EGFR的表达呈负相关,ajap1低表达和EGFR高表达肿瘤预后不良;EGFR可以改变细胞骨架,增强胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力;ajap1介导EGFR在胶质瘤发展中的新机理

关键词：胶质瘤 ajap1 EGFR/EGFRVⅢ 细胞骨架预后

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