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甘油/正丁醇联合妥布霉素杀灭金黄色葡萄球菌的机制探究

甘油/正丁醇联合妥布霉素杀灭金黄色葡萄球菌的机制探究

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作者：黄雪冰福建师范大学

学位级别：硕士

细菌耐药已经发展成为全球性公共卫生问题。抗生素增效减毒是应对细菌耐药危机的重要策略。本课题组前期研究发现,甘油和正丁醇都可以增强氨基糖苷类抗生素杀灭金黄色葡萄球菌,但各自的杀菌机制尚未清楚。从遗传学角度寻找参与甘油/正... 详细信息

细菌耐药已经发展成为全球性公共卫生问题。抗生素增效减毒是应对细菌耐药危机的重要策略。本课题组前期研究发现,甘油和正丁醇都可以增强氨基糖苷类抗生素杀灭金黄色葡萄球菌,但各自的杀菌机制尚未清楚。从遗传学角度寻找参与甘油/正丁醇增效杀菌的关键基因,并揭示关键基因在甘油/正丁醇联合妥布霉素杀灭金黄色葡萄球菌中的作用机理,可为今后实际应用提供理论依据,也可根据作用机理发掘更适合的抗生素佐剂,因而具有重要的研究价值。本研究采用独特的常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,创建金黄色葡萄球菌突变文库,经过3轮筛选富集获得对甘油/正丁醇联合妥布霉素处理耐受的突变株,对耐受菌株进行全基因组测序并与野生型菌株全基因组序列进行比对,获得与甘油联合妥布霉素处理耐受相关的突变基因glpK,以及与正丁醇联合妥布霉素处理耐受相关的突变基因adhp。通过同源重组技术分别构建金黄色葡萄球菌的glpK与adhp单基因敲除菌株,测试甘油/正丁醇联合妥布霉素处理的杀菌效果,结果显示,与野生型相比,△glpK对甘油联合妥布霉素处理更耐受,而△adhp对正丁醇联合妥布霉素处理更耐受。而回补及过表达Glp K或Adh P能够观察到菌株对联合处理敏感性的恢复或增加。另外,也发现大肠杆菌glpK或adhp敲除株比野生型大肠杆菌更耐受联合处理,大肠杆菌过表达Glp K/Adh P后对联合处理更敏感,与金黄色葡萄球菌的观察结果一致。这些结果表明,glpK是参与甘油增强妥布霉素杀菌的关键基因,adhp是参与正丁醇增强妥布霉素杀菌的关键基因。进一步的研究表明,△glpK与ARTP诱变获得的glpK诱变株(ARTP-2A)降低甘油联合处理时的金黄色葡萄球菌对妥布霉素的摄取,△adhp与ARTP诱变获得的adhp诱变株(N-10H)降低了正丁醇联合处理时妥布霉素的摄取。探究抗生素摄取与细胞膜的流动性的关系时发现,甘油/正丁醇能够增强金黄色葡萄球菌的细胞膜流动性,而敲除株△glpK/△adhp与野生型相比细胞膜流动性减弱。另外在探究甘油代谢与能量之间的关系时发现,甘油处理能够提高金黄色葡萄球菌的ATP与质子动力势(PMF)水平,但对敲除株△glpK没有效果。故认为正丁醇增强妥布霉素摄取与细胞膜流动性有关,而甘油增强妥布霉素摄取与细胞膜流动性及ATP与PMF水平都有关。另外,本研究还测试了甘油联合处理对临床耐药金黄色葡萄球菌的杀菌效果,结果显示甘油联合氨基糖苷类抗生素对大部分临床耐药金黄色葡萄球菌也保持良好的杀菌效果。综上所述,本研究以金黄色葡萄球菌为研究对象,基于ARTP诱变技术结合定向筛选以及分子生物学手段,证明了glpK是参与甘油增强妥布霉素杀菌的关键基因,而adhp是参与正丁醇增强妥布霉素杀菌的关键基因。另外还发现甘油/正丁醇增强妥布霉素摄取与细胞膜流动性有关,且甘油可以通过代谢提高ATP与PMF水平促进妥布霉素的摄取。

关键词： ARTP诱变抗生素佐剂金黄色葡萄球菌 glpK adhp

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巴氏醋杆菌代谢酶基因的克隆与表达

巴氏醋杆菌代谢酶基因的克隆与表达

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作者：闫玉婷西北大学

学位级别：硕士

醋酸菌属于革兰氏阴性细菌,因其良好的耐醇性、耐酸性和乙酸发酵能力而成为重要的工业用菌种。在食品生产工业,特别是食醋酿造中具有重要作用。食醋酿造与醋酸菌中催化乙醇向乙酸转化的代谢酶密切相关。醋酸菌中乙酸的形成主要由多亚基... 详细信息

醋酸菌属于革兰氏阴性细菌,因其良好的耐醇性、耐酸性和乙酸发酵能力而成为重要的工业用菌种。在食品生产工业,特别是食醋酿造中具有重要作用。食醋酿造与醋酸菌中催化乙醇向乙酸转化的代谢酶密切相关。醋酸菌中乙酸的形成主要由多亚基的膜结合型乙醇脱氢酶(ADH)与乙醛脱氢酶(ALDH)催化完成,除此之外,醋酸菌胞浆中还存在一些单一多肽链为活性形式的ADH、ALDH以及一些能够催化乙酸彻底氧化为二氧化碳和水的酶类。利用这些代谢酶实现离体条件下乙醇向乙酸的转化,具有比较深远的社会意义。本实验以非膜结合型、单一多肽链为活性形式的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶为着眼点,选择***菌株CICC22518中的adh P、NAD(P)-adh和ald A三种基因作为研究对象,利用基因重组技术构建携带目的基因的重组表达载体,选用更快捷、成本更低、生长周期更短的大肠杆菌表达系统进行醋酸菌来源的部分脱氢酶的外源表达,通过镍柱纯化获得具有高活性的重组酶,以期为乙醇向乙醛或乙酸的离体转化及相关酶制剂的研发奠定实验基础。目的:对巴氏醋杆菌部分乙酸代谢酶进行表达、纯化与活性分析方法:(1)在Gen Bank数据库中查询目的基因序列,利用Snap Gene软件分析并化学合成;(2)通过基因重组技术构建目的基因表达载体;(3)IPTG诱导重组蛋白的表达;(4)超声破碎细胞结合SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性;(5)镍柱纯化并收集重组蛋白;(6)利用Image J软件进行电泳图灰度分析;(7)Bradford法检测蛋白质含量;(8)铁氰化钾还原法检测重组酶活性。结果:(1)构建了表达载体pET28a(+)-adh P、pET28a(+)-NAD(P)-adh、pET28a(+)-ald A和pET28a(+)-NAD(P)-adh-ald A;(2)SDS-PAGE分析结果显示adhp和NAD(P)-ADH在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达与积累,ALDA和NAD(P)-ADHALDA在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性形式表达与积累;(3)镍柱纯化获得adhp、NAD(P)-ADH、ALDA和NAD(P)-ADH-ALDA四种重组蛋白,回收率分别为90.13%、85.78%、94.33%和92.89%;(4)酶含量检测和酶活性分析结果显示,adhp的乙醇脱氢酶活力显著高于NAD(P)-ADH-ALDA,极显著高于NAD(P)-ADH,分别高出98.12%和175.21%,对乙醇的催化能力最强,达277.5±7.07 U/m L。重组的融合酶蛋白NAD(P)-ADH-ALDA对乙醇的催化活力极显著高于NAD(P)-ADH,为256.667±6.24U/m L,对乙醛的催化活力也比ALDA高出了101.94%,达到173.333±3.12 U/m L,说明基因重组没有降低相应酶的催化活性。结论:本实验利用大肠杆菌表达系统高效表达了醋酸菌乙酸代谢酶adhp、NAD(P)-ADH、ALDA和NAD(P)-ADH-ALDA,纯化回收的重组酶具有较高的催化活性和纯度,为进一步开发离体条件下转化乙醇为乙酸的酶制剂和相关基础研究奠定了实验基础。

关键词：巴氏醋杆菌 adhp NAD(P)-ADH ALDA 蛋白纯化

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过氧化物模拟酶信号放大无标记DNA荧光检测方法的研究

过氧化物模拟酶信号放大无标记DNA荧光检测方法的研究

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作者：薄红艳陕西师范大学

学位级别：硕士

DNA是储存遗传信息的双螺旋大分子,它携带着人类及其他生物的遗传信息,指导各类型蛋白质的合成。根据已知的基因片段来确定与检测序列有关的疾病,对受检者的DNA序列进行测定和定位分析的基因测序显得尤为重要。目前,DNA序列的测定方法... 详细信息

DNA是储存遗传信息的双螺旋大分子,它携带着人类及其他生物的遗传信息,指导各类型蛋白质的合成。根据已知的基因片段来确定与检测序列有关的疾病,对受检者的DNA序列进行测定和定位分析的基因测序显得尤为重要。目前,DNA序列的测定方法有很多种,传统的DNA测序方法一般采用凝胶电泳法,近十多年来,光学方法由于其非破坏性和高灵敏度成为最成熟的DNA检测技术。其中荧光法以其灵敏度高而广泛用于DNA检测。本论文由以下三部分组成。第1章绪论本章介绍分子信标的结构和原理,重点概述分子信标特点,G-quadruplex结构及其应用。同时介绍模拟酶概念和理论设计,过氧化物模拟酶简介以及应用。最后阐述本论文的选题背景,研究意义,研究目的及研究内容。第2章过氧化物模拟酶信号放大无标记DNA荧光检测方法的研究本章构建了一种非标记荧光增强型检测目标DNA的方法。这种新型的非标记分子信标由茎环结构的发卡型DNA探针和外源荧光染料10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪(adhp)组成。这种新型分子信标其茎部为富含G碱基的DNA寡核苷酸序列,与分子信标另一茎状部分互补配对。当有目标DNA存在时,这种富含G碱基的DNA序列可以从分子信标的茎环结构中解离出来,在K+存在下,形成K+稳定的G-quadruplex,与氯化血红素(Hemin)作用后,形成G-quadruplex-Hemin复合物,表现出过氧化物酶的活性,催化adhp-H2O2反应。adhp本身不发荧光,G-quadrupl ex-Hemin复合物催化H202分解的同时,将adhp氧化,其氧化产物可以发荧光。通过检测荧光信号,可以间接检测目标DNA。基于G-quadruplex-Hemin复合物的模拟酶具有酶活性,随着催化时间延长产物大量积累,因而有效的放大了荧光信号提高了检测灵敏度。研究发现,当加入含单碱基错配的目标DNA时,荧光信号明显弱于全匹配的DNA,表明非标记荧光分子信标可以用于区分完全互补链和单碱基错配。实验证明目标DNA在(1×10-11-1×10-8mol/L)表现出一定的线性关系。线性回归方程为1=2.0c(n mol/L)+33.6,检出限为3.0×10-12mol/L,相对标准偏差R2=0.994。我们所设计的新型非标记分子信标可以用于高灵敏检测目标DNA。第3章基于过氧化物模拟酶光度法检测葡萄糖本章利用富含G碱基的DNA在在氯化血红素和K+存在下,形成K+稳定的G-quadruplex,能够表现出过氧化物酶活性。葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下,生成葡萄糖酸和H2O2。该过氧化物模拟酶在催化H2O2分解的同时,将底物adhp由无色变成其的氧化产物为有色物质,随着葡萄糖的增加,其紫外—可见吸光度也增加,实现了光度法检测葡萄糖。本文利用双酶体系有效放大信号,提高了检测灵敏度。该比色分析法响应速度快,所用仪器设备简单。在优化实验条件下,实验证明葡萄糖在(10-100umol/L)表现出一定的线性关系。线性回归方程为A=0.003c (umol/L)+0.046,检出限为30×10-6mol/L,相对标准偏差R2=0.998。我们所设计的新型分子探针可以用于高灵敏检测葡萄糖。

关键词： DNA 分子信标过氧化物模拟酶荧光 adhp 葡萄糖

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