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IL-1β对大鼠终板软骨细胞增殖的影响及机制研究

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IL-1β对大鼠终板软骨细胞增殖的影响及机制研究

作者：梁小微河北医科大学

学位级别：硕士

目的:相间盘退变为多种因素综合影响所致,有报道表明,软骨终板发生钙化所引发椎间盘营养物质供应下降为椎间盘启动的关键性因素。本实验通过培养大鼠椎体终板软骨细胞,检测adamts-5蛋白的表达水平与IL-1β是否具有相关性,在IL-1β炎性... 详细信息

目的:相间盘退变为多种因素综合影响所致,有报道表明,软骨终板发生钙化所引发椎间盘营养物质供应下降为椎间盘启动的关键性因素。本实验通过培养大鼠椎体终板软骨细胞,检测adamts-5蛋白的表达水平与IL-1β是否具有相关性,在IL-1β炎性因子的干预下,通过检测磷酸化p65蛋白,p65蛋白含量的变化,来探究IL-1β是否促进adamts-5的表达通过NF-κB信号通路,从而促进终板软骨细胞退变,为预防和治疗椎间盘退变提供新的方法。方法:取4-6周龄大鼠椎体的终板软骨细胞进行纯化,通过原代及传代培养。选择生长较好的3代细胞进行实验,通过观察细胞的形态,来描绘细胞的生长曲线。1.采用MTT法研究不同浓度的IL-1β对大鼠终板软骨细胞增殖的影响。通过在紫外分光光度计上测定各孔光吸收值,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标,观察细胞增殖变化。2.研究不同浓度的IL-1β(5 ng/ml,10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)对大鼠终板软骨细胞adamts-5蛋白表达的影响。3.培养皿中加入10 ng/mL的IL-1β,观察24、48、96小时,大鼠椎板软骨细胞中adamts-5蛋白表达量的变化。4.培养皿中加入10 ng/mL的IL-1β,设立空白对照,通过检测磷酸化p65蛋白含量,p65蛋白含量的变化,来探究IL-1β是否通过激活NF-κB信号通路促进adamts-5的表达。5.将大鼠椎体终板软骨细胞分为4组,第一组为空白对照组,第二组加入10 ng/mL的IL-1β,第三组加入50 ug/ml NF-κB信号通路的阻断剂SN50,第四组加入10 ng/mL的IL-1β及50 ug/ml SN50,观察adamts-5蛋白表达量的变化,从而验证IL-1β是否通过激活NF-κB信号通路促进adamts-5的表达。结果:1.随IL-1β浓度增高,大鼠终板软骨细胞数目逐渐减少,且各组之间差异具有统计学意义(P5)。2.不同浓度的IL-1β对大鼠终板软骨细胞adamts-5蛋白表达与空白对照组相比都有增强,且各组之间差异具有统计学意义(P5)。10 ng/ml的IL-1β作用最强。3.不同时间点,10 ng/ml的IL-1β对大鼠终板软骨细胞adamts-5蛋白表达与空白对照组相比都有增强,且各组之间差异具有统计学意义(P5),48小时达到高峰。4.与空白对比,10 ng/ml IL-1β作用大鼠终板软骨细胞48小时后,p-p65蛋白浓度明显升高,而p65蛋白浓度基本保持不变。两组之间差异具有统计学意义(P5)。5.四组不同干预蛋白分别作用于大鼠终板软骨细胞,其adamts-5蛋白表达量从高到低分别为IL-1β组,IL-1β+SN50组,空白对照组,SN50组。且各组之间差异具有统计学意义(P5)。结论:***-1β能够抑制大鼠终板软骨细胞的增殖。***-1β对大鼠终板软骨细胞增殖的抑制可能是部分通过影响NF-κB信号通路实现的。

关键词： IL-1β adamts-5 SN50 NF-κB信号通路大鼠终板软骨细胞

卵巢切除术构建骨关节炎动物模型的可行性研究

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卵巢切除术构建骨关节炎动物模型的可行性研究

作者：李楠第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变及继发性滑膜炎症为特征的骨骼系统疾病,以中老年人常见。流行病学研究表明,50岁以前,男性的骨关节炎发病率略高于女性;50岁以后,女性的发病率显着高于男性。大量研究表明... 详细信息

研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变及继发性滑膜炎症为特征的骨骼系统疾病,以中老年人常见。流行病学研究表明,50岁以前,男性的骨关节炎发病率略高于女性;50岁以后,女性的发病率显着高于男性。大量研究表明,绝经后女性失去雌激素保护和关节炎症细胞因子水平异常在骨关节炎的发病中起着重要作用。另外,雌激素替代治疗(estrogen-replacement therapy,ERT)对骨关节炎症状有一定的缓解作用,也说明了雌激素与绝经后骨关节炎的发生可能存在相关性。骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种退行性骨骼系统代谢疾病,以单位体积内骨量低于正常、骨强度降低而脆性增加为特征,主要表现为全身骨量减少、骨的显微结构紊乱导致骨的脆性增加,容易发生骨折。其病因也十分复杂,但与骨关节炎相同的是,骨质疏松症也多发于绝经后妇女和老年人。卵巢切除术(Ovariectomy,OVX)建立骨质疏松的动物模型,研究较为成熟。而目前骨关节炎的动物模型多采用手术方法构建,如前交叉韧带横断术、内侧半月板切除术等,通过改变关节周围应力,导致关节不稳定,从而诱发骨关节炎;但是由于此类模型属关节内干预,加上手术造成的关节内出血、创伤及炎症影响,不能很好的模拟绝经后骨关节炎的自然发生发展过程。本实验拟通过关节外干预,观察雌激素缺乏在骨关节炎和骨质疏松症发生过程中的作用,并且通过对骨关节炎相关细胞因子检测,探所这一过程发生的分子机制。研究目的1.验证卵巢切除这一关节外干预方式,能否用来构建骨关节炎动物模型;2.模型建立后,提取并培养骨关节炎软骨细胞,加入雌激素干预,检测MMP-3、MMP-13、adamts-5三种蛋白水解酶表达水平的改变,观察雌激素在这一过程中的作用。研究方法1.选择6月龄雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术,构建骨关节炎动物模型。2.采用显微镜下大体观察,系统评分,以及对关节组织进行番红固绿染色行组织学观察,评价模型质量。3.用酶两步法提取模型动物骨关节炎软骨细胞及正常雌性大鼠关节软骨细胞,并对关节炎软骨细胞施加雌激素干预,荧光实时定量PCR检测MMP-3、MMP-13、adamts-5基因在各组细胞中的相对表达量。*** blot检测MMP-3、MMP-13、adamts-5在三组软骨细胞中的蛋白表达量。实验结果1.采用卵巢切除术构建骨关节炎动物模型,其关节软骨病变程度达到骨关节炎诊断标准。2.提取关节软骨细胞进行原代培养,传代后提纯,采用荧光实时定量PCR检测MMP-3、MMP-13、adamts-5基因在骨关节炎软骨细胞中的表达水平,结果显示MMP-3表达量明显增高,与对照组相比P5;MMP-13、adamts-5的表达呈下降趋势,与对照组相比P5。*** blot结果显示,MMP-3、MMP-13、adamts-5在骨关节炎软骨细胞的分泌表达趋势与上述结果一致。4.在骨关节炎培养液中加入雌激素干预后,可以改变骨关节炎软骨细胞MMP-3、MMP-13的表达水平,使其趋向正常软骨细胞。结论1.卵巢切除术可以用来建立骨关节炎的动物模型,以模拟绝经后女性骨关节炎的自然发生过程。2.与正常关节软骨细胞相比,MMP-3在骨关节炎软骨细胞中明显表达增加,提示其与骨关节炎的发生呈正相关,这与文献报道的结果一致;而MMP-13、adamts-5表达水平降低,和依靠改变关节周围应力构建的动物模型的分子表达水平有差异,提示其与采用卵巢切除构建的骨关节炎动物模型可能存在发生机制上的差异。3.在细胞水平上,雌激素能够在一定程度上逆转骨关节炎软骨细胞MMP-3、MMP-13的表达,提示雌激素对关节软骨细胞具有保护作用。

关键词：骨关节炎雌激素软骨细胞骨质疏松 MMP adamts-5

OA软骨细胞中TGFβ/Smad3介导miRNA-140调控ADAMT-5表达的实验性研究

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OA软骨细胞中TGFβ/Smad3介导miRNA-140调控ADAMT-5表达的实验性...

作者：王超石河子大学

学位级别：硕士

背景/目的:转化生长因子受体(TGFβ)能影响关节软骨的代谢稳态和结构的完整,而microRNA-140和adamts-5在关节软骨的代谢中起着非常重要的作用,本文拟探究TGFβ/Smad3在OA软骨细胞中对microRNA-140调节adamts-5表达的影响。方法:利用酶... 详细信息

背景/目的:转化生长因子受体(TGFβ)能影响关节软骨的代谢稳态和结构的完整,而microRNA-140和adamts-5在关节软骨的代谢中起着非常重要的作用,本文拟探究TGFβ/Smad3在OA软骨细胞中对microRNA-140调节adamts-5表达的影响。方法:利用酶消化法体外提取SD大鼠(2-3周)的膝关节软骨细胞,通过显微镜下观察软骨细胞的生长基本形态和软骨细胞甲苯胺蓝染色来鉴定软骨细胞;通过IL-1的炎症诱导其成为OA软骨细胞。首先在OA软骨先报中通过质粒转染microRNA-140 mimics和microRNA-140 inhibit,并且使用adamts-5抑制剂作为阳性对照组、空白组(标准培养基)和空质粒组分别于24、48、72小时用Real-time PCR分别检测adamts-5的mRNA的表达,同时在72小时用Western blot检测adamts-5的表达来验证microRNA-140对adamts-5的调节;然后再通过在OA软骨细胞中分别加入Smad3激动剂(重组人Smad3蛋白)、Smad3抑制剂(SIS3)、阳性对照(adamts-5抑制剂)和阴性对照(标准培养基)分别于24、48、72小时用Real-time PCR分别检测microRNA-140和adamts-5的mRNA的表达,同时在72小时用Western blot检测adamts-5的表达来验证Smad3在OA软骨细胞中对microRNA-140调节adamts-5表达的影响。结果:1.软骨细胞为不规则的多角形,甲苯胺蓝染色结果胞质为浅蓝色,细胞核为深蓝色。***-time PCR显示在OA软骨细胞中microRNA-140mimics组较microRNA-140inhibit组、阳性对照组(adamts-5抑制剂)、空白组(标准培养基)合空质粒组明显降低adamts-5 mRNA的表达(P5),并且在72小时Western blot显示microRNA-140mimics组较microRNA-140 inhibit组、阳性对照组(adamts-5抑制剂)、空白组(标准培养基)和空质粒组明显降低adamts-5的表达(P5)。***-time PCR显示在OA软骨细胞中Smad3抑制剂(SIS3)较Smad3激动剂(重组人Smad3蛋白))、阳性对照(adamts-5抑制剂)和阴性对照(标准培养基)在48和72h时microRNA-140的表达明显增高(P5),同时检测发现adamts-5 mRNA的表达明显减低(P5),并且在72小时Western blot显示Smad3抑制剂(SIS3)较Smad3激动剂(重组人Smad3蛋白))、阳性对照(adamts-5抑制剂)和阴性对照(标准培养基)明显降低adamts-5的表达(P5)。结论:TGFβ/Smad3在OA软骨细胞中可以影响microRNA-140对adamts-5的调节作用。

关键词： Smad3 microRNA-140 adamts-5 OA软骨细胞

重组人白介素-1受体拮抗剂治疗大鼠颞下颌关节骨关节炎的动物模型研究

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重组人白介素-1受体拮抗剂治疗大鼠颞下颌关节骨关节炎的动物模型...

作者：徐凡遵义医学院

学位级别：硕士

目的:探讨II型胶原酶对大鼠髁突软骨基质降解的影响以及重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)对大鼠TMJOA的治疗作用,为临床TMJOA的治疗研究提供一定理论依据。方法:1、选取2月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,采取一次性单侧颞下颌关节... 详细信息

目的:探讨II型胶原酶对大鼠髁突软骨基质降解的影响以及重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)对大鼠TMJOA的治疗作用,为临床TMJOA的治疗研究提供一定理论依据。方法:1、选取2月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,采取一次性单侧颞下颌关节腔Ⅱ型胶原酶注射法建立大鼠TMJOA动物模型,对照侧注射等量生理盐水,利用HE染色及改良Mankin评分法研究Ⅱ型胶原酶对大鼠TMJ髁突软骨组织形态的影响;2、同前法建立大鼠TMJOA单侧模型,通过逆转录PCR(RT-PCR)、免疫组化染色(IHC)等实验手段探索adamts-4,adamts-5在大鼠TMJOA中的表达变化;3、同前法建立大鼠TMJOA双侧模型,一周后实验侧颞下颌关节腔内注射重组人IL-1Ra,对照侧注射等量生理盐水,采用HE、免疫组化染色、RT-PCR等实验手段研究大鼠TMJ髁突软骨组织形态改变及adamts-4、adamts-5的表达。结果:1、实验侧髁突软骨出现退行性变,表现为髁突软骨及关节盘表面胶原纤维逐步裂解,软骨细胞数量减少,层次紊乱;对照侧髁突软骨及关节盘表面光滑连续,细胞排列层次清楚,依次分为纤维层、增殖层、肥大层和钙化软骨层;实验侧1周时评分为:0.67±0.58,2周时为:1.67±0.58;3周时为:2.67±0.58;4周时为:6.00±1.00。实验侧4周时病损最为严重(P5);2、实验侧adamts-4,adamts-5阳性细胞主要表达于增殖层和肥大层,在4周时突入纤维层。对照侧主要表达于肥大层。实验侧adamts-4,adamts-5 m RNA与蛋白表达在4周时均高于对照侧(P5),且在4周时均高于2周实验侧(P5)。实验侧adamts-5 m RNA在2周,蛋白在4周时表达高于adamts-4(P5)。3、实验侧关节病变较对侧轻,病变多局限于髁突软骨及关节盘表面。对照侧髁突软骨及关节盘表面胶原纤维裂解,关节软骨萎缩,软骨细胞数量减少,层次紊乱。实验侧2周时评分为:1.33±0.52,对照侧为:2.00±0.63。两者无明显差异(P>0.05);实验侧4周时评分为:3.00±0.63,对照侧为:6.50±0.84。实验侧关节软骨病损明显较对侧轻(P5)。实验侧adamts-4,adamts-5阳性细胞主要表达于肥大层。对照侧表达于纤维层、增殖层及肥大层。实验侧adamts-4,adamts-5 m RNA与蛋白表达在4周时均低于对照侧(P5)。实验侧adamts-5 m RNA在2周和4周时均高于adamts-4(P5)。结论:1、adamts-4,adamts-5均在大鼠TMJOA病变早期起作用,相比adamts-4,adamts-5的作用更为明显;2、IL-1Ra可促进早期TMJOA大鼠髁突软骨的修复,其治疗机制可能为抑制蛋白聚糖酶的表达,相比adamts-5,IL-1Ra抑制adamts-4表达的效果更为明显。

关键词： IL-1 adamts-4 adamts-5 IL-1Ra

骨保护素基因治疗抑制类风湿关节炎软骨破坏的实验研究

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骨保护素基因治疗抑制类风湿关节炎软骨破坏的实验研究

作者：封志云浙江大学

学位级别：硕士

前言类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种病因未明,以反复发作的慢性小关节炎为主的疾病,其特征为关节滑膜增生以及关节软骨与软骨下骨的破坏。导致患者关节畸形、功能丧失以致生活能力下降的主要因素是软骨和骨的破坏。目前... 详细信息

前言类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种病因未明,以反复发作的慢性小关节炎为主的疾病,其特征为关节滑膜增生以及关节软骨与软骨下骨的破坏。导致患者关节畸形、功能丧失以致生活能力下降的主要因素是软骨和骨的破坏。目前尚无有效抑制该进程的方法。在骨关节炎动物模型中观察到,骨保护素(Osteoproegein, OPG)可以有效抑制软骨和软骨下骨的破坏。在佐剂诱导关节炎动物模型(Adjuvant-induced arthritis, AIA)中也发现,经OPG治疗的大鼠膝关节软骨组织得到近乎完全保护。但是有报道指出胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)相对于AIA,其关节破坏更明显,更加接近于RA软骨的破坏。所以OPG对RA关节炎软骨的作用尚需进一步研究。而且,OPG抑制关节炎软骨破坏的病理机制尚未明了。软骨基质主要由纤维状的胶原蛋白网络和聚集的蛋白聚糖组成。软骨细胞是唯一的细胞成分,负责调节软骨的代谢。正常情况下,软骨细胞产生软骨基质。分泌多种因子,并在局部达到平衡,以调节软骨的新陈代谢和软骨基质的平衡。简言之,分解代谢因子,如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-1、3,9.13或解聚素和金属蛋白酶与血小板反应蛋白基序(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, adamts)-4,5可降解软骨的基质,而TIMP-1、2、3、4, IGF-I, TGF-β, BMP-2, bFGF等可以促进软骨基质合成,从而抑制MMPs等的作用,进而达到平衡,以保持软骨的自我更新。超负荷的压力或者炎症因子如IL-1, TNF-a等刺激可能打破软骨代谢的平衡,从而导致软骨基质降解和破坏。研究显示RA患者软骨破坏的主要原因是增生的滑膜和炎症细胞的侵蚀,但是至今并无能同时抑制滑膜炎症和软骨破坏的药物。从软骨破坏的内在机制,如软骨细胞凋亡和蛋白多糖丢失着手进一步探索,可能具有重大的临床意义。Kim等人发现,在RA患者关节软骨细胞较非RA患者软骨细胞的凋亡率显著增加。并且凋亡因子caspase3的表达在RA患者及动物模型的软骨中均明显增加。此外,通过番红O染色评估发现在CIA模型动物中蛋白聚糖丢失更为显著。表层的蛋白聚糖丢失通常是关节软骨破坏的第一步,在蛋白聚糖的降解中,adamts-4,-5是主要的降解酶。本课题首次对OPG影响软骨细胞生长和功能进行系统的研究,体外细胞实验与动物体内实验相结合,在分子生物学,细胞学和病理组织学水平探索OPG对软骨细胞的影响,并初步探讨OPG抑制RA软骨破坏的机制：1)体外验证OPG对软骨细胞的增殖能力的影响;2)探索OPG影响软骨细胞的细胞内信号通路;3)探讨OPG对软骨细胞分泌细胞因子能力的影响;4)构建携带OPG基因的腺病毒,构建RA关节炎模型CIA;5)评价OPG基因治疗CIA大鼠后的关节软骨破坏;6)探讨软骨细胞凋亡在CIA软骨破坏中的作用以及OPG基因治疗对软骨细胞凋亡的影响;7)评价OPG基因治疗后adamts-5的分泌水平的改变。第一部分骨保护素对体外软骨细胞增殖及分泌功能的影响目的体外研究骨保护素(osteoprotegerin, OPG)对软骨细胞增殖能力和分泌功能的影响。方法从1周龄SD大鼠的膝关节中,采用胶原酶消化法获取原代软骨细胞。甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。本实验应用第一代软骨细胞。细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测5,10,20,25,50,100,200ng/ml浓度OPG对软骨细胞增殖能力的影响。以MEK抑制剂U0126, ERK抑制剂PD098059, P38MAPK抑制剂SB203580预处理30分钟,再加入OPG刺激,进行CCK-8试验,用以探索OPG对软骨细胞通路的影响。MAPK家族中的三条信号通路关键蛋白ERK, P38MAPK和JNK由蛋白质免疫印迹法(western-blotting)检测刺激后磷酸化水平。定量PCR和western-blotting测定OPG刺激后软骨细胞分泌的细胞因子和组成成分表达量的变化。结果OPG在5-50ng/ml浓度能促进软骨细胞增殖,最佳效应浓度为10ng/ml。 U0126,PD098095可以显著抑制OPG诱导的软骨细胞增殖。OPG刺激后15分钟,软骨细胞内MEK和ERK蛋白的磷酸化分别增强至0分钟时的4.12倍和3.50倍,而P38MAPK和JNK的蛋白磷酸化则无明显变化。OPG显著下调软骨细胞adamts-5分

关键词：骨保护素软骨细胞增殖 MEK/ERK adamts-5 TIMP-4 OPG 软骨破坏胶原诱导的关节炎细胞凋亡 adamts-5 基因治疗早期治疗

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软骨蛋白聚糖酶与骨性关节炎

中国骨质疏松杂志 2010年第11期16卷 889-893页

作者：廖乐乐王万春中南大学湘雅二医院骨科长沙410011

骨性关节炎(osteoarthrits OA)是以关节软骨缺损为特点的一种退行性的骨关节疾病,其病因目前尚不十分清楚,但多种蛋白水解酶活性增高而引起的软骨外基质(extracellular matrix,ECM)的降解异常是软骨退变的重要原因,其中软骨蛋白聚糖酶(a... 详细信息

骨性关节炎(osteoarthrits OA)是以关节软骨缺损为特点的一种退行性的骨关节疾病,其病因目前尚不十分清楚,但多种蛋白水解酶活性增高而引起的软骨外基质(extracellular matrix,ECM)的降解异常是软骨退变的重要原因,其中软骨蛋白聚糖酶(aggrecanase)引起的软骨蛋白聚糖降解在骨性关节炎早期阶段是一个重要的事件,此酶(特别是adamts-4和adamts-5)在骨性关节炎软骨中对软骨蛋白聚糖的降解起到重要作用,已经得到大家广泛的关注,目前已将它作为治疗OA的新靶点。此综述将此类酶与OA的关系及在OA中的作用及研究进展作一归纳。

关键词：软骨蛋白聚糖骨性关节炎 adamts-4 adamts-5

腺病毒介导的骨保护素基因治疗通过抑制蛋白聚糖水解和软骨细胞凋亡减轻类风湿关节炎的软骨破坏

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腺病毒介导的骨保护素基因治疗通过抑制蛋白聚糖水解和软骨细胞凋...