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江苏医药 2019年第6期45卷 599-601页

作者：刘宏斌朱燕杨其昌施超沈屹南通市第一人民医院病理科

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对EC109食管癌细胞增殖的影响。方法采用RNA干扰技术靶向人adam17基因的siRNA,分别标记为si257、si258及si259 3个序列,转染入EC109人食管癌细胞;采用实时定量PCR法检测各组癌细胞adam17 mRNA的含量;采用CCK8... 详细信息

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对EC109食管癌细胞增殖的影响。方法采用RNA干扰技术靶向人adam17基因的siRNA,分别标记为si257、si258及si259 3个序列,转染入EC109人食管癌细胞;采用实时定量PCR法检测各组癌细胞adam17 mRNA的含量;采用CCK8实验检测adam17沉默后食管癌细胞EC109的细胞增殖变化。结果 3个序列均能够有效抑制EC109中adam17的表达,显示有效的基因沉默效果。转染后72 h si259对EC109的增殖能力具有抑制作用(Padam17基因能够对食管癌细胞增殖产生一定的影响,提示ADMA17基因通过某种通道参与了食管癌细胞的增殖活动。

关键词：小干扰RNA adam17基因细胞增殖食管癌

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siRNA介导的adam17基因沉默对前列癌PC3细胞增殖和凋亡的影响

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中国实验诊断学 2020年第7期24卷 1183-1186页

作者：李雪冯树强李然伟田文杰姜爽杨贺吉林大学第二医院泌尿外科吉林长春130041

目的探究RNA干扰靶向沉默adam17基因对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响。方法构建针对adam17的小干扰RNA(siRNA)表达质粒PGC-siadam17,脂质法稳定转染PC3细胞,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞adam17 mRNA的基因表达,噻唑... 详细信息

目的探究RNA干扰靶向沉默adam17基因对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响。方法构建针对adam17的小干扰RNA(siRNA)表达质粒PGC-siadam17,脂质法稳定转染PC3细胞,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞adam17 mRNA的基因表达,噻唑蓝(MTT)法测定瘤细胞增值率,原位未端标记(TUNEL)法检测瘤细胞凋亡率,流式细胞术(FCM)检测瘤细胞周期比例。结果 PGC-si adam17使PC3细胞adam17蛋白分泌水平下调,对PC3细胞增殖的抑制率为53.6%,对细胞凋亡率为12.7%,同时使GO/G1期细胞增多,S期细胞减少。上述所有统计数据分别与相应的对照组比较,差异均有统计学意义(Padam17-si RNA表达质粒可抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡,adam17有望成为提高前列腺癌靶向治疗的新基因。

关键词：前列腺癌 adam17基因 RNA干扰

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RNAi沉默adams家族基因对肿瘤细胞生物学活性的影响

RNAi沉默ADAMs家族基因对肿瘤细胞生物学活性的影响

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作者：丰菁华中科技大学

学位级别：硕士

研究背景肿瘤细胞的微环境在肿瘤的发生和发展中占有至关重要的作用。解整合素金属蛋白酶adams(A Disintegrin and Metalloproteases)是一类Zn2+依赖性的胞外肽酶,在肿瘤细胞微环境的调节中有着一定的作用。由于这类蛋白质分子都含有... 详细信息

研究背景肿瘤细胞的微环境在肿瘤的发生和发展中占有至关重要的作用。解整合素金属蛋白酶adams(A Disintegrin and Metalloproteases)是一类Zn2+依赖性的胞外肽酶,在肿瘤细胞微环境的调节中有着一定的作用。由于这类蛋白质分子都含有金属蛋白水解区及解整合素区,因此将这类蛋白称为adams[1]。它们在生物的发育、生存过程中的作用是多方面的,包括细胞的融合与迁移、生物活性因子的附着、释放、受精、以及细胞内信号传导等[2]。本课题组一直致力于以adam17为代表的炎症方面的研究并取得了一定的进展,如对三类TACE(adam17)抑制剂作用机理的探讨[3]。有研究表明adam17可定位于人脑的神经元,AD(Alzheimer’s disease)患者的adam17表达水平虽然没有变化,但在老年斑和神经原纤维缠结中也发现了adam17。同时adam10与APP的体内加工有密切关系,由此级联到其上游前体蛋白加工酶PC7,从而探讨其在转基因后的生物学效应成为本课题组研究的新靶点。adams在淀粉样蛋白前体加工中起重要作用,目前证实,一些因淀粉样蛋白前体沉积造成的神经系统疾病,与adams的蛋白水解活性降低有密切关系[4]。后来又新奇的发现这类家族基因在肿瘤细胞中高表达。并且已有研究表明有些分泌型adams,如adam11和adamTS-1,在某些肿瘤细胞系表达,表明它们可能与肿瘤形成有关。文献中已有相关报道[5,6,7],adam17高表达于肿瘤组织中,它主要以前体的方式定位于肿瘤细胞表面其中包括乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌和前列腺癌等,adam10在神经细胞瘤中过度表达。既然adams家族基因已经被报道在动物模型和癌症患者中肿瘤的形成、侵袭和转移中占有重要的一席之地。设想我们敲除adams家族基因将会抑制肿瘤信息的复制与传递,由此这类基因将会成为癌症治疗不错的新靶标。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)诱发同源基因的表达沉默,该技术因其高效且特异的靶基因抑制而在基因肿瘤功能研究以及肿瘤等疾病的基因治疗中显示出巨大的潜在应用价值,尤其是小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)[8]。在较早的哺乳动物实验中,siRNA是通过化学合成法合成的,但它虽可高效特异性地抑制外源性和内源性基因的表达,但同时存在操作费时费力,价格昂贵,抑制效果维持时间短等缺点。为了能够在哺乳动物中高效、持续表达siRNA,克服上述困难,拓展RNAi技术的应用。使用质粒DNA构建的shRNA表达载体,可以在细胞内生成小干扰性RNA,抑制目的基因的表达,使得哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能[9,10]。本研究以adam17,adam10和PC7基因为研究重点,采用小发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的RNA干扰技术和转基因技术,来探讨adams与肿瘤的密切关系,即抑制该基因的表达可能对肿瘤细胞的生物学效应会有重要的影响。通过研究其对肿瘤细胞的发生发展所发挥的干扰作用,以阐明其在基因治疗中的潜在意义,从而为研究这些特定基因在肿瘤治疗中的机制奠定了基础,同时也为探索基因治疗对抗肿瘤的新策略、新靶点提供了一定的理论基础和实验依据。第一部分RNAi沉默adam17基因对多种肿瘤细胞增殖和凋亡的影响目的:探讨RNA干扰技术沉默adam17基因表达在肿瘤细胞增殖和凋亡中的影响,以其为研究靶标,为对抗肿瘤的基因治疗提供潜在的依据和手段。方法:采用小发夹结构RNA ( shRNA)介导的RNA干扰技术,利用本实验室已构建好的adam17干扰载体pGensil-1-TACE,用脂质体介导重组真核干扰载体转染四株肿瘤细胞(Hela,HepG2,SGC-7901,MCF-7),建立瞬时转录系统,观察转染后绿色荧光蛋白EGFP的表达情况评估转染效率。培养一周并观察其对肿瘤细胞生长状态的影响,采用Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FACS)检测转染重组干扰质粒后细胞的凋亡状况。MTT比色法测定细胞增殖的抑制,观察转染前后各组肿瘤细胞增殖能力的变化。结果:干扰真核表达载体成功转入四株肿瘤细胞,荧光显微镜观察其转染效率,其在24h时转染率高达80%。MTT检测显示,沉默细胞增殖能力与阴性质粒对照组和空白对照组相比显著降低(Padam17基因沉默后,各组肿瘤细胞增殖能力明显降低并诱

关键词： adam17基因 RNA干扰肿瘤细胞(Hela,HepG2,SGC-7901,MCF-7) 增殖凋亡短发夹状RNA adam10 N2a细胞株基因干扰

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先天性少毛症基因诊断与新致病基因搜寻

先天性少毛症基因诊断与新致病基因搜寻

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作者：郑璐瑶上海交通大学

学位级别：硕士

目的:（1）研究先天性少毛症/羊毛状发家系的临床表现和遗传模式,寻找新的致病基因。（2）研究单纯性先天性少毛症和Bjornstad综合征的临床表现,确定患者的致病基因突变。基因检测不仅可以明确患者的诊断,同时还可以为患儿父母的产前基... 详细信息

目的:（1）研究先天性少毛症/羊毛状发家系的临床表现和遗传模式,寻找新的致病基因。（2）研究单纯性先天性少毛症和Bjornstad综合征的临床表现,确定患者的致病基因突变。基因检测不仅可以明确患者的诊断,同时还可以为患儿父母的产前基因诊断提供指导。方法:（1）对先天性少毛症/羊毛状发家系进行病理学检查,用扫描电镜观察患者毛发的超微结构,收集该家系的血液样本,进行全基因组连锁分析、单倍型分析和测序以确定新的致病基因,然后在工具细胞中对新基因进行进一步的功能研究。（2）采集一例单纯性先天性少毛症家系的血样,并对该家系进行二代靶向测序及突变位点验证,明确患儿的致病基因突变。（3）采集一例Bjornstad综合征家系的血样,并对该家系进行二代靶向测序及突变位点验证,明确患儿的诊断。结果:（1）我们发现一个新的与先天性少毛症/羊毛状发家系相关的致病基因,定位于2号染色体,该突变为adam17基因的杂合错义突变c.1939G＞A（p.D647N）。在m RNA水平,adam17在野生型和突变型质粒中均表达增加,而TGFα和EGFR在野生型和突变型质粒中的表达几乎没有变化。在蛋白质水平上,野生型和突变型adam17的表达增加,但TGFα在野生型和突变型质粒中的表达几乎没有变化。另外,EGFR在野生型质粒中表达无明显变化,在突变型质粒中表达减少。（2）单纯性先天性少毛症患儿的致病基因突变是SNRPE基因的c.54+2T＞A杂合突变。（3）Bjornstad综合征患儿在BCS1L基因发现两处复合杂合突变,分别为c.818del C缺失突变和c.917G＞A错义突变。结论:我们发现了导致先天性少毛症/羊毛状发的新的致病基因,同时明确了一例单纯性先天性少毛症患儿以及一例Bjornstad综合征患儿的致病基因突变位点,明确了临床诊断。

关键词：先天性少毛症全基因组关联分析 adam17基因 Bjornstad综合征二代靶向测序

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