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桃果实中acc合酶基因克隆及基因沉默载体构建

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中国农学通报 2009年第12期25卷 34-37页

作者：王廿张红星朱本忠罗云波韩涛北京农学院北京102206 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。acc合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默acc合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得acc合酶基因。将该基因酶... 详细信息

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。acc合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默acc合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得acc合酶基因。将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5α,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定。测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99%,表明将acc合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上。

关键词：桃 acc合酶基因克隆载体构建基因沉默

黄瓜全雌性相关的RAPD标记及acc合酶基因的克隆

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黄瓜全雌性相关的RAPD标记及ACC合酶基因的克隆

作者：周晓艳曲阜师范大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L．)是葫芦科重要的蔬菜作物，其性别表现复杂多样，是研究植物性别决定和性别分化的良好实验材料。雌花发生的早晚及其分布状态，即性型表现，与黄瓜成熟早晚、产量和品质等有密切的关系。目前全雌性或强雌性是... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L．)是葫芦科重要的蔬菜作物，其性别表现复杂多样，是研究植物性别决定和性别分化的良好实验材料。雌花发生的早晚及其分布状态，即性型表现，与黄瓜成熟早晚、产量和品质等有密切的关系。目前全雌性或强雌性是黄瓜优势育种的重要途径。但由于黄瓜性别表现受到遗传和环境等多种因素的影响，应用传统方法从表型上进行全雌性基因的选择效率不高。近年来，黄瓜的分子标记辅助育种技术日益受到研究人员的关注。它可以弥补传统育种方法的不足，提高其准确性，加速育种进程。开展DNA分子标记研究是进行黄瓜分子标记辅助选择育种、分离和克隆基因的基础。遗传学分析表明，黄瓜的性别表型受3类基因F、m、a的控制，其中F基因控制雌性表达。在几类植物激素中，生长素、乙烯可强化植物的雌性表达，植株茎端乙烯的形成与雌花的分化存在很大相关性。由于acc合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶，因而acc合酶在高等植物性别表达过程中的作用已受到人们的关注。许多研究者认为acc合酶基因与控制黄瓜雌性的F位点存在紧密连锁关系。本文利用RAPD技术，筛选与黄瓜全雌性状相关的分子标记，同时将RAPD标记转换为特异性和稳定性好的SCAR标记，为实现黄瓜的早期性别鉴定与全雌性状的分子辅助育种提供依据。另外，通过对acc合酶基因的克隆和测序，试图找到黄瓜不同品系中acc合酶基因的差异，比较其与黄瓜不同性别表达类型的关系，探讨该基因在黄瓜性别决定过程中的作用。结果报告如下：(1) CTAB法提取黄瓜核基因组总DNA，采用RAPD技术对39条随机引物进行初步筛选，其中有12条引物显示多态性，以此作为筛选全雌性特异的分子标记的候选引物。(2)对多态性引物进一步筛选，引物S10和S435可以在全雌系黄瓜中扩增出两条稳定、清晰的特异条带，大小约2000bp和500bp，分别记作S10-2kb和S435-0.5kb，而对照单株(雌雄同株)中不存在。可见，这两个分子标记具有性型特异性。(3)对S10-2kb和S435-0.5kb两个特异分子标记进行回收、克隆并测序，获得全长DNA序列，大小分别为2003bp和470bp。经BLAST分析，发现S10-2kb分子标记与数据库中已知的黄瓜序列同源性低，该片段可能为黄瓜中新发现的DNA序列;对S435-0.5kb序列而言，所有的同源序列均与葫芦科植物无关，该标记系黄瓜中新发现的DNA序列。两个分子标记已提交GenBank注册，序列号分别是EF 057801和EF 062502。ORF Finder分析表明，S10-2kb序列含有最长能编码62个氨基酸的开放读框;而S435-0.5kb序列，其最长的ORF编码68个氨基酸。以上两个分子标记编码短肽的生理功能尚不确定，其生物学意义有待进一步研究。(4)依据2003bp序列设计两对特异引物(CS1和CS2)，将RAPD标记转化为SCAR标记。扩增结果显示，引物CS1在转化过程中失去了多态性，而CS2能够在全雌品系黄瓜中扩增出目的条带，雌雄同株黄瓜中却不出现，表明成功转化为SCAR标记，可作为黄瓜苗期性别鉴定的一对特异引物。(5)根据已发表的acc合酶基因序列，设计一对专一性引物，以全雌、强雌和弱雌性黄瓜品系为材料进行PCR扩增。在全雌和强雌品系中获得预期大小的DNA片段，而弱雌品系则不存在。经克隆和测序分析，获得全长1042bp的序列，比前人报道的序列长1bp，而最长ORF编码的氨基酸序列则完全一致;经BLASTn检索，发现与黄瓜CS-ACS1、CS-ACS1G基因同源性最高(同源性为85％左右)，初步推断该片段为acc合酶基因(ACSG)。鉴于ACSG与雌性系表型之间存在一定的相关关系，ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。另外，可以检索到与葫芦科其他作物和蔷薇科acc合酶基因有较高同源性，与十字花科、豆科、茄科等植物的acc合酶基因具有低度的同源性。结论：RAPD技术用于寻找黄瓜全雌性状相关的分子标记是可行的，在RAPD的基础上将其转化为SCAR标记可提高MAS的准确性和效率。本文获得的一对SCAR特异引物CS2，可用于黄瓜苗期性别鉴定;acc合酶基因存在于全雌系和强雌系黄瓜中，为雌性系特有。通过克隆获得了全雌性黄瓜中的acc合酶基因序列(ACSG)。鉴于ACSG与雌性系表型之间存在一定的相关关系，认为ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。

关键词：黄瓜(Cucumis sativus L.) 全雌性 RAPD标记筛选 SCAR标记 acc合酶基因

不同性别表型黄瓜基因组中雌性系特异的acc合酶基因

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Acta Botanica Sinica 2000年第2期42卷 164-168页

作者：叶波平吉成均杨玲玲杨中汉王永建曹宗巽北京大学生命科学学院北京100871 清华大学生物科学与技术系北京100084 北京市农林科学院北京100082

利用一对引物 (引物 1和引物 2 )分别从雌性系黄瓜 (CucumissativusL .)品种“CORONA”、“DALEVE”和强雌性黄瓜品种“中农五号”、“欧洲八号”的基因组DNA中扩增到一长约 10 2 5bp的acc合酶基因片段。序列分析表明 :该基因片段与Treb... 详细信息

利用一对引物 (引物 1和引物 2 )分别从雌性系黄瓜 (CucumissativusL .)品种“CORONA”、“DALEVE”和强雌性黄瓜品种“中农五号”、“欧洲八号”的基因组DNA中扩增到一长约 10 2 5bp的acc合酶基因片段。序列分析表明 :该基因片段与Trebitsh等 1997年发表的acc合酶基因片段的同源性大于 99% ,认为这两个基因片段应该是同一个基因 ,不同品种来源的该基因的相同性说明了其高度的保守性 ,并暗示了该基因在黄瓜性别决定中的重要作用。此基因片段与其他在不同诱导条件下表达的acc合酶基因的同源性较低 (小于 70 % )。Southern分析表明此基因片段与黄瓜的性别表型有关 ,是雌性系黄瓜特有的。此基因的存在与黄瓜的雌性表达为“有”和“无”的关系 ,其拷贝数的多少与雌性表达强弱并无直接相关性 ,暗示在黄瓜中另有与雌性表达强弱有关的基因。

关键词：黄瓜雌性系性别表达 acc合酶基因

乙烯和1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因参与玫瑰花发育过程中细胞程序化死亡的调控(英文)

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植物生理与分子生物学学报 2005年第4期31卷 354-360页

作者：潘海春李继红王宪泽山东农业大学生命科学学院泰安271018 魏兹曼科学研究所植物科学系

作为植物有性繁殖器官——花的花瓣通常生命周期短,其中有一个敏感的、严格控制的细胞程序化死亡过程。为了揭示细胞程序化死亡过程中发生的反应或者其组成成分,解释玫瑰花发育过程中的细胞程序化死亡过程的机理,测定了在整个花发育过... 详细信息

作为植物有性繁殖器官——花的花瓣通常生命周期短,其中有一个敏感的、严格控制的细胞程序化死亡过程。为了揭示细胞程序化死亡过程中发生的反应或者其组成成分,解释玫瑰花发育过程中的细胞程序化死亡过程的机理,测定了在整个花发育过程中玫瑰花瓣的乙烯释放速率、acc合酶基因的转录产物(mRNA)、acc合酶活性以及acc含量。结果显示在花发育过程前期(阶段1、2)检测不到乙烯产生,在花瓣完全绽开时花瓣中乙烯开始产生。在花发育后期(阶段4、5)花的衰老与乙烯释放速率的升高同时发生。在花发育前期没有acc合酶基因的转录产物积累,该基因在花瓣完全绽开时开始表达,在花发育后期逐渐增强。acc合酶活性与acc含量的变化趋势与乙烯的一致。在玫瑰花发育后期乙烯诱导和调控花瓣的细胞程序化死亡。acc合酶基因、acc合酶以及acc都是玫瑰花瓣程序化死亡过程中的重要调控因子。

关键词：玫瑰乙烯 acc合酶基因细胞程序化死亡

黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布

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中国蔬菜 2008年第1期 10-13页

作者：邹晓艳李锡香沈镝王海平中国农业科学院蔬菜花卉研究所

根据已有的决定黄瓜雌性的acc合酶基因CS-ACS1G,与黄瓜性型有关的acc氧化酶基因CS-ACO2、CS-ACO3,与黄瓜雌性相关的乙烯受体基因CS-ETR2和CS-ERS的序列,通过设计特异引物,对不同性型黄瓜品种基因组DNA进行扩增。结果表明,5个基因在本试... 详细信息

根据已有的决定黄瓜雌性的acc合酶基因CS-ACS1G,与黄瓜性型有关的acc氧化酶基因CS-ACO2、CS-ACO3,与黄瓜雌性相关的乙烯受体基因CS-ETR2和CS-ERS的序列,通过设计特异引物,对不同性型黄瓜品种基因组DNA进行扩增。结果表明,5个基因在本试验所用的不同性型黄瓜品种的基因组中均能被检测到,说明这5个性别决定相关基因在本试验中不具有雌性特异性。通过PCR克隆在全雌性黄瓜品种G5224中获得了长度为1124bp的acc合酶基因序列。BLAST分析表明,本试验所获得的acc合酶基因序列和Trebitsh公布的CS-ACS1G基因序列的同源程度为99%,表明PCR扩增产物确实为CS-ACS1G基因。此基因在基因组中表现不具雌性特异性的现象与多数研究者的结论相悖。

关键词：黄瓜基因组性别决定 acc合酶基因 acc氧化酶基因乙烯受体基因

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桃果实acc合酶cDNA的克隆

园艺学报 2000年第4期27卷 257-262页

作者：金勇丰张耀洲浙江大学生物化学研究所杭州310029

根据其它植物acc合酶氨基酸保守区设计两组简并引物 ,用套式PCR技术从桃成熟果实cDNA中扩增出 1.1kb大小特异性片段 ,将其克隆至pGEM T载体上 ,对重组克隆pPACSI进行全序列测定表明 ,插入片段全长 110 0个碱基 ,编码 36 6个氨基酸 ,该... 详细信息

根据其它植物acc合酶氨基酸保守区设计两组简并引物 ,用套式PCR技术从桃成熟果实cDNA中扩增出 1.1kb大小特异性片段 ,将其克隆至pGEM T载体上 ,对重组克隆pPACSI进行全序列测定表明 ,插入片段全长 110 0个碱基 ,编码 36 6个氨基酸 ,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果acc合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为 72 .7% ,71.3% ,71.1% ,6 9.1% ,6 5.4 %。RNA点杂交表明pPACSI基因随着桃果实成熟表达活性增强 ,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。

关键词：桃 acc合酶基因克隆序列分析果实成熟

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黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选

上海农业学报 2003年第4期19卷 11-14页

作者：陈劲枫娄群峰余纪柱庄飞云南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室南京210095 上海市农业科学院园艺研究所上海201106

利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用 30 0个 1 0碱基的随机引物按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增 ,筛选出 5个在全雌和弱雌株基因池 (genepool)中表现多态性的引物... 详细信息

利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用 30 0个 1 0碱基的随机引物按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增 ,筛选出 5个在全雌和弱雌株基因池 (genepool)中表现多态性的引物。单株检测表明 ,引物B1 1具有全雌特异性 ,在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约 1 0 0 0bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此 ,将该全雌性特异的片段命名为B1 1 1 0 0 0 。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外 ,以acc合酶基因 (CS ACS1 )特异引物检测分离群体单株 ,发现该酶基因存在于所有性型的单株中。

关键词：黄瓜 RAPD 性别基因分子标记基因池引物分离克隆随机扩增多态性DNA acc合酶基因

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乙烯引发真菌侵袭

生物技术通报 1995年第4期11卷 17-17页

作者：孙雷心

许多采摘后发生的果实病害都是由潜伏的真菌在果实成熟时引发的。那么,真菌怎么知道该何时发起攻击呢?一项新的研究表明,是刺激果实成熟的乙烯使真菌产生附着胞,刺透果实表皮。美国Ohio州立大学的Moshe ***和Pappachan ***监测了多种成... 详细信息

许多采摘后发生的果实病害都是由潜伏的真菌在果实成熟时引发的。那么,真菌怎么知道该何时发起攻击呢?一项新的研究表明,是刺激果实成熟的乙烯使真菌产生附着胞,刺透果实表皮。美国Ohio州立大学的Moshe ***和Pappachan ***监测了多种成熟果实对附着在显微镜玻片上的真菌刺盘孢孢子的影响。他们发现番茄、颚梨和香蕉促使附着胞产生,但柑桔不然。柑桔是无呼吸峰果实,即在成熟过程中不产生乙烯。另外,带有反义acc合酶基因的转基因番茄(不产生乙烯)

关键词：乙烯真菌附着胞 acc合酶基因果实成熟转基因番茄果实病害成熟过程刺盘孢成熟果实