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草莓果实成熟相关的abcC转运蛋白和蔗糖转运蛋白基因的筛选和功能鉴定

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草莓果实成熟相关的ABCC转运蛋白和蔗糖转运蛋白基因的筛选和功能...

作者：冯欢安徽农业大学

学位级别：硕士

花青素属于植物的次生(级)代谢物,是构成草莓果实颜色的主要色素,对于形成果实外观品质至关重要。花青素不仅具有十分重要的生物学功能,如可以保护植物自身抵抗低温、紫外线和病虫害等,更有重要的保健和医疗功能。花青素苷一般是在细胞... 详细信息

花青素属于植物的次生(级)代谢物,是构成草莓果实颜色的主要色素,对于形成果实外观品质至关重要。花青素不仅具有十分重要的生物学功能,如可以保护植物自身抵抗低温、紫外线和病虫害等,更有重要的保健和医疗功能。花青素苷一般是在细胞质中合成,而在液泡中贮藏。同时,蔗糖是一种在植物体内广泛存在的初级代谢物,在植物生长和发育过程中具有重要作用。因此,本论文开展花青素和蔗糖在细胞内的转运相关研究,对于阐释花青素和蔗糖在果实内的累积过程和果实品质形成的分子机理,以及采用相关栽培措施提高果实品质都具有重要的理论意义和实践价值。本课题组在前期项目研究中,以‘丰香’草莓为试材,采用砂培法进行不同氮形态(NO-N、NH-N、NO-N+NH-N、无氮)处理,发现不同氮形态处理对果实发育和着色具有不同效应。同时,通过对不同氮形态处理草莓果实的代谢组学分析,鉴定得到与处理效应相关的生物标记物(biomarkers),并将其衍射到KEGG database的相关代谢途径。结果显示,共有7个biomarkers注释到abc transporters路径中,表明abc转运蛋白参与不同氮形态调控草莓果实发育和成熟过程。为此,本试验以甜查理草莓转色期果实为试材,根据前期转录组和代谢组的整合分析结果,克隆得到1个abcC转运蛋白基因Fa abcC1和一个蔗糖转运蛋白基因Fa SUC3,并进行相关生物信息学分析。采用实时定量PCR技术,对Fa abcC1和Fa SUC3在草莓七个不同发育时期以及四个不同器官中的表达模式进行分析。采用分光光度法测定花青素在草莓七个不同发育时期花青素含量的变化,同时,采用荧光定量PCR方法,比较花青素合成相关功能基因在草莓不同发育时期的表达模式。构建干涉表达载体p Hellsgate2-Fa abcC1和p Hellsgate2-Fa SUC3以及过量表达载体pCXSN-Flag-FaabcC1、pCXSN-Flag-FaSUC3,进行基因转化和功能验证研究。本试验主要取得如下结果:1.以花后30d的甜查理草莓果实为试材,克隆得到1个abc转运蛋白基因Fa abcC1;测序结果显示,Fa abcC1的ORF由4518个碱基组成,共编码1505个氨基酸;系统进化树分析结果表明,它与拟南芥At MRP4同源性最高,蛋白多序列蛋白比对结果显示,它与已鉴定具有花青素转运功能的Vv abcC1和Zm MRP3同源性较高,初步预测该基因也具备转运花青素的功能。洋葱表皮细胞亚细胞定位结果显示,Fa abcC1-GFP融合蛋白定位于细胞膜,通过对根、叶、花、转色期果实四个不同发育器官的时空表达模式分析,在根中相对表达量最高,花、叶次之,在果实中表达量最低。在草莓七个不同发育时期果实的表达模式分析结果表明,FaabcC1在转色期表达显著上调,表明此基因可能与花青素转运即果实成熟相关。构建了植物干涉表达载体p Hellsgate2-Fa abcC1,并成功转化二倍体草莓,最终得到抗性芽若干个;同时,构建了超表达载体p CXSN-Flag-Fa abcC1,并成功转化拟南芥,最终得到转基因植株5棵。2.以花后30d的甜查理草莓果实为试材,克隆得到1个蔗糖转运蛋白基因Fa SUC3;测序结果显示,Fa SUC3的ORF由1815个碱基组成,共编码604个氨基酸。系统进化树结果表明,它与拟南芥At SUC3同源性最高,而At SUC3属于SUT2亚族,表明Fa SUC3可能也是SUT2亚族的一员。洋葱表皮细胞亚细胞定位结果显示,Fa SUC3-GFP融合蛋白定位于细胞膜。草莓七个不同发育时期果实表达分析结果表明,Fa SUC3转色期表达显著上调,表明此基因可能与果实成熟相关。构建了植物干涉表达载体p Hellsgate2-Fa SUC3,并成功转化二倍体草莓,最终得到抗性芽若干个;同时,构建了超表达载体pCXSN-Flag-FaSUC3,并成功转化拟南芥,最终得到转基因植株2棵。3.在草莓七个不同发育时期果实中,花青素在小绿果、大绿果、绿白果和白果时期积累非常少,在转色期果实中花青素含量开始增加,在成熟期果实中花青素含量达到最高,至过熟期后花青素含量便开始降低。4.对花青素合成相关功能基因的实时荧光定量PCR分析,结果表明,CHS1/3基因在花青素的生物合成途径中发挥关键作用,而F3H1和ANS1基因在红果的八倍体草莓甜查理中表达模式与花青素积累呈现显著的正相关,而在白果的二倍体草莓Hawaii4转色期果实中其表达量很低,表明ANS1和F3H1对于花青素的积累起到关键作用。从草莓基因组中鉴定得到UFGT1-8,在八倍体草莓甜查理的PCR定量分析发现,UFGT1基因在转色期表达较高,其他基因均只在草莓小绿果时期表达量较高;二倍体草莓Hawaii4中结果却相反,在转色期几

关键词：草莓 abc转运蛋白蔗糖转运蛋白花青素果实成熟

猪链球菌2型三磷酸腺苷结合蛋白转运蛋白SSU05_0948突变株的构建及其致病性

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中华传染病杂志 2018年第4期36卷 234-239页

作者：骈亚亚高振祥聂晶晶张然胡继红北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心 100730

目的探讨猪链球菌2型三磷酸腺苷结合蛋白转运蛋白转运蛋白SSU05_0948突变株的致病性，为了解猪链球菌逃避宿主天然免疫提供线索。方法根据同源重组技术构建SSU05_0948突变株05ZYH33Δ0948；通过细菌黏附、全血杀伤、小鼠脑膜炎实验、小... 详细信息

目的探讨猪链球菌2型三磷酸腺苷结合蛋白转运蛋白转运蛋白SSU05_0948突变株的致病性，为了解猪链球菌逃避宿主天然免疫提供线索。方法根据同源重组技术构建SSU05_0948突变株05ZYH33Δ0948；通过细菌黏附、全血杀伤、小鼠脑膜炎实验、小鼠和仔猪攻毒实验全面评价突变株和野生株在致病性方面的差异。统计学分析采用卡方检验和t检验。结果成功构建了基因SSU05_0948的突变株05ZYH33Δ0948。黏附结果显示，野生株对A549的黏附率为（0.663±0.047）%，高于突变株的（0.246±0.074）%，比较差异有统计学意义（χ2＝5.267，P＝0.014）；野生株对Hep2的黏附率为（16.540±2.320）%，高于突变株的（1.970±0.320）%，比较差异有统计学意义（χ2＝0.014，P〈0.01）；野生株对HBMEC的黏附率为（5.497±0.174）%，高于突变株的（1.950±0.335）%，比较差异有统计学意义（χ2＝0.016，P〈0.01）。野生株在全血中的杀伤率为（32.970±3.589）%，突变株在全血中的杀伤率为（29.560±3.740）%，比较差异无统计学意义（χ2＝1.200，P＝0.133）。仔猪竞争感染实验显示，12 h竞争感染指数为0.046±0.003，24 h竞争感染指数为0.107±0.003，36 h竞争感染指数为0.064±0.001，12 h和24 h比较差异有统计学意义（t＝15.490，P＝0.041），24 h和36 h比较差异有统计学意义（t＝5.660，P＝0.047），2 h和36 h比较差异无统计学意义（t＝ 1.445，P＝0.285）。结论猪链球菌2型abc转运蛋白SSU05_0948是新发现的黏附因子和毒力因子，是引起脑膜炎的新致病因子，在猪链球菌抗宿主天然免疫中发挥重要作用。

关键词：脑膜炎猪链球菌2型基因敲除 abc转运蛋白

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甲硫氨酸转运蛋白中的构象变化的研究

甲硫氨酸转运蛋白中的构象变化的研究

作者：杨振宁吉林大学

学位级别：硕士

细胞的生存需要特殊蛋白质分子跨膜进行可调节的和专一性的运输，不仅是为了获得营养或排出废物，而且也有调节和其他功能的需要。以这些特殊蛋白质为媒介的跨膜运输和细胞膜联系密切。这些蛋白质的识别以及它们在细胞生理中的作用很多... 详细信息

细胞的生存需要特殊蛋白质分子跨膜进行可调节的和专一性的运输，不仅是为了获得营养或排出废物，而且也有调节和其他功能的需要。以这些特殊蛋白质为媒介的跨膜运输和细胞膜联系密切。这些蛋白质的识别以及它们在细胞生理中的作用很多年来已经成为一个研究的焦点。现在已经清楚这些数不清的膜转运系统可以分为数量有限的几个家族，在每一个家族内成员之间在序列和分子机理上都彼此相关，并且可能拥有一个共同的进化上的起源。我们研究的是这些家族中最大的也是分布最广泛的家族，abc超家族。每一个abc转运蛋白都相对专一于一种给定的底物，尽管如此，由不同转运蛋白运输的底物的种类非常广泛，具体的abc转运蛋白的底物包括氨基酸，糖类，无机盐，多糖，肽，甚至蛋白质也能成为转运蛋白的底物。abc转运蛋白最近已经获得很多注意因为他们在原核或真核生物中和很多重要的生物过程有关，以及一些临床问题，比如囊肿性纤维化，抗原呈递和肿瘤细胞的多药抗性。abc转运蛋白的名称确认了一个高度保守的ATP-结合盒，这个盒是这个超家族最明显的特征。自从第一个高分辨率的abc晶体大肠杆菌维他命B12在2002年出现以来，很多输入体以及输出体的晶体都被结晶出来。abc转运蛋白包含两个跨膜域或单体（TMDs）形成运输通道，和两个核苷酸结合域或单体（NBDs）水解ATP。根据运输方向的不同abc转运蛋白最早分为两个种类。输入体，在原核细胞中发现的，包含额外的细胞外或细胞表面关联的结合蛋白，它们高亲和性地获得蛋白质所需要的底物并且把底物传递到跨膜域上。输出体，直接从细胞或磷脂双分子膜中获得底物。不同种类跨膜域间的序列相似性很低，然而核苷酸结合域却高度保守，每个单体包含一个拥有Walk-A模体，Walk-B模体的RecA型的亚结构域，和一个拥有LSGGQ模体的α螺旋亚结构域。在甲硫氨酸转运蛋白中除了核心的四个结构域外，在核苷酸结合域单体下还有一个碳末端调节域C2域单体，而这个C2域单体在结构上可划为ACT域。人们已经发现当细胞内甲硫氨酸浓度过高时运输过程就会停止，这种现象叫做转运抑制。为了理解一个处于转运抑制状态的转运蛋白回到非抑制的，休眠态过程中的构象变化以及其中的机理，我们做了转运蛋白中有或没有底物的拉伸分子动力学模拟。从模拟中我们看到在整个abc转运蛋白中的一些重要的构象变化，包括跨膜域中运输通道的缩小还有核苷酸结合域彼此接近。然而在两种模拟里C2域的表现却是不同的。这些发现可能有助于解释C2域的构象变化与核苷酸结合域或跨膜域的重排之间的联系，并且从一个反方向提供了一种理解转运抑制的方法。

关键词： abc转运蛋白转运抑制 C2结构域拉伸分子动力学模拟

微小隐孢子虫转运蛋白免疫原性及微小隐孢子虫和鸵鸟源小鼠隐孢子虫寄生部位初步研究

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微小隐孢子虫转运蛋白免疫原性及微小隐孢子虫和鸵鸟源小鼠隐孢子...

作者：牛姝婉河南农业大学

学位级别：硕士

隐孢子虫是一种全球范围内的人兽共患寄生性原虫,可导致免疫抑制群体致死性腹泻,具有重要的公共卫生意义,目前尚未发现可以防治的特效药。abc转运蛋白是一类跨膜蛋白家族,此家族成员可以利用ATP水解产生的能量将其结合的底物跨膜转运。... 详细信息

隐孢子虫是一种全球范围内的人兽共患寄生性原虫,可导致免疫抑制群体致死性腹泻,具有重要的公共卫生意义,目前尚未发现可以防治的特效药。abc转运蛋白是一类跨膜蛋白家族,此家族成员可以利用ATP水解产生的能量将其结合的底物跨膜转运。abc蛋白广泛存在于各种生物体内,和营养转运,药物、内外毒素的吸收排泄有关。因此,我们有必要对隐孢子虫转运蛋白进行初步研究,研究其作为药靶的潜在可能性。本研究通过推测的10个微小隐孢子虫转运蛋白等膜蛋白部分序列,在NCBI数据库中Blast得到对应基因片段及基因描述,通过Clustal X1.83把推测出来的小肽和由基因片段翻译出来的完整蛋白质序列进行序列比对,确定了这些小肽在完整蛋白质上的位点。使用各个完整的蛋白质序列Blast并未搜索到同源序列,因此也证明了这些小肽具有特异性。委托合成的9条多肽做了纯度鉴定和组分鉴定。并将9个合成多肽中的6个和载体蛋白BSA偶联制备了全抗原,并用SDS-PAGE做鉴定确定偶联成功;以EC-BSA等完全抗原为免疫原,选择2Kg体重的日本大耳白兔6只进行免疫。首先,EC-BSA PBS等完全抗原溶液与等体积的FCA混合成乳剂,背部皮下多点注射,剂量是每只1 mg完全抗原;每隔14日以同剂量完全抗原溶液与等体积的FIA混成乳剂免疫。共免疫6次,第6次加强免疫剂量是2mg/只。第三次免疫后每隔2周测一次血清效价。ELISA检测条件为抗原1:100稀释,包被后4℃过夜,1%BSA-PBST为包被液,血清1:100及倍比稀释,最终平行测定以血清1:1000做平行比较,P/N≥2为阳性,结果均为阳性。效价分别是兔1 (LC) 0.573、兔2 (IC) 2.047、兔3 (KC) 1.727、兔4 (KC-P436) 1.993、兔5 (RC ) 1.985、兔6 (LC-1) 1.497。使用H.E、PAS、甲苯胺兰几种染色的方法染色病理组织观察虫体、宿主感染组织以及炎性细胞。利用实验室保存C. parvum卵囊和C. muris卵囊感染沙鼠进行了初步的病理组织学和超微结构的研究,确定C. parvum主要寄生在沙鼠十二指肠、空肠、回肠,引起肠道微绒毛变短脱落。C. muris在沙鼠主要寄生部位是贲门、幽门和胃底。本试验利用推测并合成的微小隐孢子虫转运蛋白及相关蛋白等部分序列制备出兔多抗血清,为进一步研究微小隐孢子虫转运蛋白等膜蛋白在虫体及宿主之间的定位打下基础。也为研究隐孢子虫的代谢研究做出铺垫。

关键词：隐孢子虫 abc转运蛋白多克隆抗体石蜡切片

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P糖蛋白抑制剂和底物的理论预测研究

P糖蛋白抑制剂和底物的理论预测研究

作者：陈磊苏州大学

学位级别：硕士

abc (ATP-binding cassette)转运蛋白是一大类在众多器官中都有表达的跨膜蛋白。abc转运蛋白能够阻止有毒物质进入细胞,从而达到保护细胞的作用。P糖蛋白(P-gp)是abc转运蛋白家族最具有代表性的蛋白之一。P-gp结构为同源二聚体,每个单... 详细信息

abc (ATP-binding cassette)转运蛋白是一大类在众多器官中都有表达的跨膜蛋白。abc转运蛋白能够阻止有毒物质进入细胞,从而达到保护细胞的作用。P糖蛋白(P-gp)是abc转运蛋白家族最具有代表性的蛋白之一。P-gp结构为同源二聚体,每个单体由两束α螺旋和两个核苷酸结合区构成,分子量为170kD,由1280个氨基酸残基组成。P-gp与药物的结合口袋主要位于α螺旋区。核苷酸结合区的功能为与ATP结合,为P-gp与底物的结合与转运过程提供能量。研究表明,P-gp能够转运化学性质和结构多样性的药物,引起多药耐药(MDR)现象,导致癌症治疗的失败,此外,P-gp通过药物与药物相互作用,影响药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)性质。因此,P-gp抑制剂和底物的研究对于癌症治疗和药物的ADME’性质具有重要的意义。论文的研究工作主要分为两个部分。在第一部分中,我们首次报道了迄今最大的P-gp抑制剂数据库,该数据库包括已分类为P-gp抑制剂和非抑制剂的1273分子。接下来,基于973个分子组成的训练集,我们采用递归拆分方法建立了P-gp抑制剂的预测模型,并用300个分子组成的测试集对模型进行了评估。最好的模型可以准确预测测试集中83.5%的抑制剂和67.0%的非抑制剂。最后,我们采用贝叶斯方法建立了预测模型。贝叶斯模型的预测精度明显优于决策树模型：贝叶斯模型对973个分子的训练集和300个分子的测试集的预测精度分别为81.7%和81.2%。我们发现引入分子结构指纹参数能明显提高模型的预测精度。此外,采用分子指纹建立的贝叶斯模型给出了一些对P-gp抑制活性具有较大影响的分子结构片断,分析这些结构片断对设计新的有效的P-gp抑制剂具有重要的价值。在第二部分中,我们收集和整理了包含822个分子的P-gp底物数据库,其中包含422个P-gp底物分子和400个P-gp非底物分子。首先,我们研究了常用的8种物理化学性质对P-gp底物和非底物的分类能力。其次,综合第一部分的P-gp抑制剂数据,我们得到了1157个分子构成的P-gp抑制剂和底物的数据库,并系统地研究了P-gp抑制剂和底物疏水性、氢键能力和分子大小方面的差异,并且采用对接方法研究了底物和抑制剂与P-gp结合的能力。此外,我们用贝叶斯方法建立了P-gp底物预测的模型,最好的模型对200个分子组成的测试集,预测精度均达到83%。同时贝叶斯方法给出了一些对P-gp底物活性影响较大的重要的片段,分析这些片段对设计新的P-gp底物有重要的意义。我们也讨论了一些分子被错误预测的原因。

关键词： P糖蛋白贝叶斯分类递归分割多药耐药性 abc转运蛋白

小菜蛾、棉铃虫中肠Cry1Ac毒素结合蛋白的异源表达及功能鉴定

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小菜蛾、棉铃虫中肠Cry1Ac毒素结合蛋白的异源表达及功能鉴定

作者：李玲利南京农业大学

学位级别：硕士

Cry1A毒素发挥毒杀作用的前提是与昆虫中肠BBMV上的受体蛋白结合。氨肽酶 N（Aminopeptidase N,APN）、钙粘蛋白（Cadherin,CAD）、碱性羧酸酯酶（Alkaline phosphatase,ALP）以及 abc 转运蛋白（ATP-binding cassette transporters,abc-transporter）是Cry 1类Bt毒素重要的结合蛋白。为了深入研究小菜蛾和棉铃虫体内上述结合蛋白与Cry1Ac毒素的互作,本研究利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统对氨肽酶、钙粘蛋白、碱性磷酸酯酶和abc转运蛋白进行了表达,并从结合性及介导细胞毒性两个方面分析这些蛋白作为Cry1Ac受体的功能性,研究结果可以为Bt毒素的作用机制和抗性机理提供参考和建议。1.小菜蛾、棉铃虫Cry1Ac毒素结合蛋白的异源表达小菜蛾体内CrylAc结合蛋白PxAPN1、PxAPN2、PxCAD、PxabcC2重组病毒的相对滴度分别为0.53、0.35、0.36、0.27 × 108pfu/ml,棉铃虫CrylAc结合蛋白HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5、HaALP2 重组病毒的相对滴度分别 0.70、1.95、1.37、1.90 × 108pfu/ml;用重组病毒感染Sf9细胞成功表达了结合蛋白PxAPN1、PxAPN2、PxCAD、PxabcC2、HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5、HaALP2,结合蛋白均定位表达在细胞膜上;PxALP、HaabcC2、HaALP1未能成功构建病毒。2.小菜蛾体内Cry1Ac结合蛋白受体功能性鉴定Cry1Ac 毒素可与重组蛋白 PxAPN1、PxAPN2、PxCAD、PxabcC2 在 Sf9 细胞膜原位结合;用系列浓度的Cry1Ac毒素处理表达结合蛋白的重组Sf9细胞后,细胞死亡率均有不同程度的提高;与重组蛋白PxAPN1、PxAPN2、PxCAD相比,PxabcC2所介导的细胞死亡率最高,在毒素浓度为200nM时细胞死亡率达到86.8%,且细胞死亡率随毒素浓度的升高而升高,表现出明显的剂量效应。结果表明PxabcC2介导了 Cry1Ac毒素对细胞的毒力,可能为Cry1Ac毒素在小菜蛾体内的功能受体之一。3.棉铃虫体内Cry1Ac结合蛋白受体功能性鉴定Cry1Ac 毒素可与重组蛋白 HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5 或 HaALP2 在 Sf9 细胞膜上原位结合;但用系列浓度的Cry1Ac毒素处理表达结合蛋白的重组Sf9细胞后,细胞死亡率有较低幅度的上升（10～30%）,而且4种重组蛋白所介导的死亡效应较为相近;在经 200nM Cry 1 Ac 毒素处理后 HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5、HaALP2所介导的细胞死亡率仅分别达到14.4%、17.2%、21.6%、31.1%,显著低于阳性对照 HaCAD（56.6%）;与 HaCAD 相比,HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5 或 HaALP2所导致的细胞死亡率没有随着毒素浓度的升高而明显上升,没有表现出明显的剂量效应。结果表明HaAPN1、HaAPN2、HaAPN5或HaALP2所介导Cry1Ac细胞毒性不明显,不是Cry1Ac在棉铃虫体内的功能受体。

关键词：氨肽酶钙粘蛋白碱性磷酸酯酶 abc转运蛋白 Cry1Ac毒素受体

拟南芥abcG36转运蛋白在木质素生物合成过程中的功能研究

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拟南芥ABCG36转运蛋白在木质素生物合成过程中的功能研究

作者：孟泓君西南大学

学位级别：硕士

木质素(Lignin)是自然界含量第二丰富的植物生物聚合物,主要沉积在维管植物的次生细胞壁中,对于营养物质运输、机械支持和植物病原体防御等生理过程至关重要。同时,木质素在工业农业生产上也有着广泛应用。木质素主要由对香豆醇(H型单体... 详细信息

木质素(Lignin)是自然界含量第二丰富的植物生物聚合物,主要沉积在维管植物的次生细胞壁中,对于营养物质运输、机械支持和植物病原体防御等生理过程至关重要。同时,木质素在工业农业生产上也有着广泛应用。木质素主要由对香豆醇(H型单体,p-coumaryl alcohol)、松柏醇(G型单体,coniferyl alcohol)和芥子醇(S型单体,sinapyl alcohol)三种单体氧化偶联产生,这些单体均通过苯丙烷代谢途径合成,最终通过过氧化物酶和漆酶在细胞壁中聚合。然而,木质素单体合成后,从胞质溶胶运输到细胞壁的机制仍不完全清楚。因此,阐明木质素单体的跨膜转运过程,对于研究木质素生物合成与次生细胞壁调控具有重要意义。经证实,木质素单体(Monolignol)的跨膜转运过程需要利用ATP水解产生的能量,这就暗示了这一过程可能需要ATP结合盒(abc)转运蛋白的参与。前人已证实,拟南芥中的H型木质素单体由AtabcG29蛋白负责转运。但木质素另外两类重要单体(G和S)如何被转运目前尚不清楚。本研究发现,拟南芥abcg36突变体的根生长明显受到G型和S型木质素单体的抑制,暗示abcG36蛋白可能参与了G型和S型木质素单体的跨膜转运,为了阐明abcG36在木质素单体转运中的生物学功能,本论文开展了深入的研究,具体结果如下:1.采用G型和S型木质素单体胁迫处理野生型(WT)拟南芥并进行转录组测序分析,发现AtabcG36转运蛋白基因表达受到显著诱导,暗示该基因可能参与G型和S型木质素单体的转运。从拟南芥中克隆了AtabcG36基因,同时筛选并鉴定获得了T-DNA插入突变体abcg36-1和abcg36-2;2.外源施加G型和S型木质素单体处理拟南芥abcg36-1、abcg36-2突变体,与野生型对照相比,abcg36-1、abcg36-2突变体表现出对G型和S木质素单体更为敏感的表型,植物生长受到抑制,根长更短;3.组织表达谱和原位杂交分析显示,AtabcG36在拟南芥根和茎中表达量较高,而在茎中木质部区域大量积累。亚细胞定位分析证实,AtabcG36蛋白定位在细胞膜上;4.组织切片分析显示,与野生型相比,突变体abcg36-1、abcg36-2中木质部细胞的细胞壁厚度变薄。木质素含量测定发现,突变体abcg36-1、abcg36-2茎中木质素积累显著降低,且木质素单体比例也发生了明显变化。荧光定量检测分析木质素合成途径的相关基因表达水平发现,与野生型相比,abcg36-1、abcg36-2突变体中重要调控因子MYB46、MYB83及关键酶基因CCR1、CAD1和CCoAOMT1等表达水平均不同程度地下调;5.在酵母中表达AtabcG36基因,能够显著增加其对G型和S型木质素单体胁迫的耐受能力。同时,AtabcG36转运蛋白也增强了酵母细胞外排G型和S型木质素单体的能力;6.进一步通过生物信息学分析,克隆了在毛果杨中AtabcG36的同源蛋白PtrabcG36。将PtrabcG36基因在拟南芥中超量表达,与野生型拟南芥相比,转基因植株表现出对G型和S型木质素单体胁迫更强的耐受性,且PtrabcG36超量表达促进了转基因拟南芥茎中木质素的合成。在酵母细胞中,PtrabcG36蛋白同样促进了G型和S型木质素单体外排。综上所述,本研究克隆了拟南芥木质素合成代谢途径上一个重要的转运蛋白基因AtabcG36,遗传和生化实验证明了该基因具有转运G型和S型木质素单体跨膜运输的能力,从而影响了拟南芥茎中木质部的发育。同样地,在木本植物杨树中AtabcG36的同源蛋白PtrabcG36也具有相似的木质素单体转运功能。本研究将有助于阐明植物体内木质素的转运机制,为木材发育调控机制的解析奠定基础。

关键词：拟南芥杨树木质素单体 abc转运蛋白

分子对接模拟酵母Pdr5p蛋白E574K突变致外排功能障碍的机制

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分子对接模拟酵母Pdr5p蛋白E574K突变致外排功能障碍的机制

作者：朱建华浙江大学

学位级别：硕士

近年来,由于器官移植病例的大量增加、癌症的化学治疗和广谱抗生素的大量使用等原因,真菌感染风险逐年增加,已成为许多疾病致死的主要原因。同时,抗真菌药物的大量使用也使得真菌的耐药性日益增强,为临床治疗带来了极大的挑战。而abc转... 详细信息

近年来,由于器官移植病例的大量增加、癌症的化学治疗和广谱抗生素的大量使用等原因,真菌感染风险逐年增加,已成为许多疾病致死的主要原因。同时,抗真菌药物的大量使用也使得真菌的耐药性日益增强,为临床治疗带来了极大的挑战。而abc转运蛋白能够将多种药物外排出细胞,是真菌多药耐药性的主要原因,也是导致药物治疗效果下降的主要原因。目前,真菌转运蛋白的转运机制还不是很清楚,也为药物设计增加了难度。在本论文中,我们把酵母跨膜蛋白Pdr5p作为研究对象。酵母Pdr5p蛋白在结构和功能上与白色念珠菌以及哺乳动物药物耐受相关的abc转运蛋白都有较高的相似性,是比较理想的研究对象。而且有研究证明跨膜螺旋末端特定位点的突变会使Pdr5p失去转运活性。根据合作实验室的结果,新发现了两个突变——E574K和E580K,能够在不破坏Pdr5p表达、膜定位和ATP酶活性的情况下,使酵母对多个药物敏感性显著增加。为了进一步解释现象背后的原理,我们借助生物信息学工具(分子对接)模拟了蛋白质与药物分子的结合。发现E574K突变会破坏Pdr5p与底物间的氢键和静电相互作用力,干扰底物与受体活性位点的结合;而E580K突变可能是通过干扰底物被Pdr5p识别的过程,使底物进出转运通道受阻。E574和E580都在TMH2上,证明TMH2在药物外排过程中发挥着重要作用。生物学的实验方法和生物信息学的计算方法基于不同的研究条件和策略,他们可以很好的互补。而且近年来随着各自技术的发展,两种方法的交叉越来越多。计算可以为实验节约成本和时间,实验可以修正和优化计算方法和策略。两种方法的结合使用不仅能够帮助我们更好地理解一些生物学问题,更可以为合理药物设计提供指导,有着广阔的应用前景。

关键词： abc转运蛋白 Pdr5p 分子对接药物耐受酵母

基因工程手段筛选Paraburkholderia caffeinilytica CF1咖啡因代谢关键蛋白

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基因工程手段筛选Paraburkholderia caffeinilytica CF1咖啡因代...

作者：杨雪莹大连工业大学

学位级别：硕士

随着技术的发展,茶叶生产过程中产生的茶废弃物的处理方法也越来越多样化,最新兴起的生物降解法,借由其绿色环保,高效便捷的优势,受到人们的广泛关注。因此研究人员从筛选菌株、研究其降解途径和降解机理等方面对生物降解咖啡因进行了... 详细信息

随着技术的发展,茶叶生产过程中产生的茶废弃物的处理方法也越来越多样化,最新兴起的生物降解法,借由其绿色环保,高效便捷的优势,受到人们的广泛关注。因此研究人员从筛选菌株、研究其降解途径和降解机理等方面对生物降解咖啡因进行了全面的研究。本实验室前期从茶园土壤中筛选出的一株能以咖啡因为唯一碳、氮源及能源生长的菌株Paraburkholderia caffeinilytica CF1,该菌株对高浓度咖啡因(20 g/L)有耐受能力,为目前所报道的咖啡因耐受能力最高的菌株。针对其能代谢高浓度咖啡因的特征,利用生物信息学分析方法从分子生物学角度探究其深层机理。在研究*** CF1的过程中获得其相似菌株Caballeronia jiangsuensis MP-1,经实验证明*** MP-1不能以咖啡因为唯一碳、氮源及能源生长,通过对比*** CF1和*** MP-1的全基因组序列,并对*** CF1差异转录组数据进行分析,在两菌株中找到一个类似的且与咖啡因代谢相关的基因簇。利用实验证明*** MP-1具有能够降解咖啡因的脱甲基酶系及相关蛋白,通过比对两者基因簇的差异,找到了四个可能与*** CF1高浓度咖啡因代谢相关的基因,将其分别命名为cdnK、cdnJ、cdnI和cdnH。通过qRT-PCR确定cdnK、cdnI、cdnJ和cdnH在有无咖啡因条件下表达量的差异,确定该四个基因受咖啡因的诱导大量转录翻译,且与*** CF1高浓度咖啡因代谢相关,克隆四个目的基因,构建基因cdnK和cdnH的表达质粒,并在大肠杆菌(***)Rostta-gamiB(DE3)-pLysS中进行表达,通过包涵体变复性的方法获得纯度较高可溶性的目的蛋白,并利用Western blot对其进行免疫印迹定性鉴定。

关键词：高浓度咖啡因代谢全基因组测序差异表达基因 abc转运蛋白