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桔小实蝇abc转运蛋白G亚家族基因表达模式及BdabcG2纯合突变品系构建

桔小实蝇ABC转运蛋白G亚家族基因表达模式及BdABCG2纯合突变品系...

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作者：何旺西南大学

学位级别：硕士

桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）隶属于双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、果实蝇属（Bactrocera）,是一种严重为害多种水果和蔬菜的害虫。由于其寄主范围广、适应能力强、抗性发展迅速,对其持续有效的防控愈加困难。AT... 详细信息

桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）隶属于双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、果实蝇属（Bactrocera）,是一种严重为害多种水果和蔬菜的害虫。由于其寄主范围广、适应能力强、抗性发展迅速,对其持续有效的防控愈加困难。ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter,abc转运蛋白）是一种能够利用ATP进而促使物质逆浓度梯度跨膜转运的蛋白,能转运多种底物如激素、脂类、次级代谢物及外源有毒物质等,从而影响昆虫的生长发育和解毒代谢等生理过程。abc转运蛋白成员众多,且每个亚家族基因功能分化剧烈,因此有必要深入且系统探讨其功能。本研究以桔小实蝇abc转运蛋白G亚家族基因（BdabcGs）为对象,在鉴定BdabcGs家族成员且分析其分子特性的基础上,系统解析其时空表达模式,明确其响应逆境胁迫的表达规律。同时,针对目标基因,采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）和CRISPR/Cas9技术探究其功能。本学位论文的主要研究结果如下:1.桔小实蝇BdabcGs生物信息学与时空表达模式解析采用生物信息学方法,分析了15个桔小实蝇abc转运蛋白G亚家族成员BdabcGs（BdabcG1～BdabcG15）编码序列的分子特性。桔小实蝇BdabcGs编码蛋白的氨基酸序列与辣椒实蝇（Bactrocera latifrons）和橄榄实蝇（Bactrocera oleae）对应蛋白的氨基酸序列相似性最高,达到90%以上。BdabcGs与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）对应基因的氨基酸序列一致性在49.2%～90.5%之间。15个BdabcGs蛋白均具有abc转运蛋白家族典型的结构特征基序,包含ATP结合位点（ATP binding site）、Walker A基序（Walker A/P-loop）、Q环（Q-loop/lid）、abc转运蛋白特征基序（abc transporter signature motif）、Walker B基序（Walker B）、D环（D-loop）、H环（H-loop/switch region）以及5～7个跨膜螺旋。15个BdabcGs蛋白均只含有1个TMD和1个NBD,且呈反向排列（NBD-TMD）,为典型的半转运蛋白,需要形成同源或异源二聚体才能行使正常的转运功能。系统发育分析表明,15个BdabcGs均属于G亚家族成员,与BdabcA和BdabcH亚家族蛋白进化关系最近。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术,检测这些基因的时空表达模式发现,BdabcGs在整个发育过程均有表达,多数基因在白蛹和刚羽化的成虫等转换阶段显著高表达;除BdabcG1和BdabcG8在卵、性成熟的雌虫及卵巢中高表达外,其它多数基因在雄虫中表达量显著高于雌虫。另外,与复眼色素转运相关的基因在不同发育阶段的表达模式与复眼发育过程相一致。BdabcGs主要在成虫或幼虫的马氏管、成虫脂肪体以及幼虫的中肠相对高表达。上述结果说明BdabcGs基因功能多样,可能分别参与解毒代谢、生长发育、色素转运等过程。2.桔小实蝇BdabcGs对环境胁迫的响应表达规律采用qPCR技术,分析BdabcGs在药剂处理、高低温短时处理、高低温品系、饥饿以及干燥处理后的m RNA水平表达规律。结果显示,桔小实蝇成虫在上述环境胁迫下,其体内BdabcGs基因响应程度有所差异。BdabcG1、BdabcG3、BdabcG8在阿维菌素处理后显著上调,BdabcG14在马拉硫磷和阿维菌素处理后显著上调,暗示这些基因可能参与应对上述两种药剂胁迫的生理过程。饥饿、干燥和低温处理后显著上调的BdabcGs基因最多,高温品系仅有1个基因（BdabcG6）显著上调,高温处理后多数基因无显著性表达变化。BdabcGs对低温的响应比高温更加敏感。值得一提的是,BdabcG6在低温短时处理、高温品系、低温品系、饥饿以及干燥处理中均显著上调,暗示该基因可能在抗逆过程中承担重要功能。综上所述,多数BdabcGs基因（10个）在不同的逆境胁迫后显著上调,暗示它们在桔小实蝇抗逆境胁迫的过程中发挥重要作用。3.桔小实蝇BdabcGs RNA干扰效率检测及表型观察采用注射法对桔小实蝇5日龄成虫递送ds RNA-BdabcGs,并于24 h后检测目标基因的RNAi效率。结果表明,所检测的10个BdabcGs基因的RNAi效率及稳定性差异较大。其中,BdabcG3、BdabcG4、BdabcG6、BdabcG10、BdabcG11的表达量与对照组（ds GFP）相比显著性下降,且较为稳定。BdabcG1、BdabcG2、BdabcG5、BdabcG8、BdabcG15不能被有效

关键词：桔小实蝇 abc转运蛋白逆境胁迫 CRISPR/Cas9 RNA干扰

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酿酒酵母abc转运蛋白基因克隆及应用于转基因植物修复研究

酿酒酵母ABC转运蛋白基因克隆及应用于转基因植物修复研究

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作者：梁树才中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

环境污染是当前人类生存与可持续发展所面临的严重问题,建立和发展清除环境污染的策略和技术已成为重要的研究领域。植物修复因其环境友好、成本低,近年来逐渐受到人们的关注,转基因植物修复已经成为当前植物修复研究的热点。已有的研... 详细信息

环境污染是当前人类生存与可持续发展所面临的严重问题,建立和发展清除环境污染的策略和技术已成为重要的研究领域。植物修复因其环境友好、成本低,近年来逐渐受到人们的关注,转基因植物修复已经成为当前植物修复研究的热点。已有的研究表明,在不同转基因植物表达金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)基因,植物络合素(phytochelatins,PCs)基因,合成谷胱甘肽(glutathione, GSH)的基因以及不同转运蛋白(transporter)基因都能够提高植物对重金属的富集或耐受。酵母abc转运蛋白属于一个大的家族,具有转运和解毒重金属和其它有毒化合物的能力,其中YCF1转运蛋白基因转化植物后提高了对重金属Cd和Pb的耐受性和累积,但酵母其它的转运蛋白对重金属耐受和累积效果尚不明确。本研究从本实验室保存的酿酒酵母中克隆了10种不同的转运蛋白基因,并分别构建植物双元表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,希望通过对这些转运蛋白在植物的表达以及对重金属富集和耐受的比较,找到比较理想的用于重金属污染修复的基因资源。结果表明,YCF1转基因烟草经分子生物学分析已经整合到烟草基因组,但T1代种子发芽和水培实验结果表明转化烟草没有提高对重金属的耐受性。其它一些相关的酿酒酵母abc转运蛋白基因转化烟草后,对当代的转基因烟草进行了初步抗重金属功能分析。结果表明,其中的YOR153,YOL075,YLR249,YFR009,和ACR3五种转运蛋白基因不同程度地提高了对不同重金属Cd、Pb、Hg的耐受性。但这些基因表达的分子生物学证据,转运蛋白在植物细胞的定位,对重金属的耐受是否存在不同机理和对不同重金属的选择性,以及其后代对重金属的耐受性是否能够稳定遗传,还有待进一步研究。

关键词：植物修复转基因植物酿酒酵母 abc转运蛋白重金属

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Hsa-miR-3178靶向RhoB调控PI3K/Akt/abc转运蛋白促进胰腺癌耐药的机制研究

Hsa-miR-3178靶向RhoB调控PI3K/Akt/ABC转运蛋白促进胰腺癌耐药的...

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作者：古健优南方医科大学

学位级别：硕士

化疗耐药是胰腺癌预后不良的重要原因。既往研究表明,ATP结合盒（abc）转运蛋白包括P糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）蛋白可调节多种癌症的耐药;此外,微小RNA（miRNAs）也参与了肿瘤的化疗耐药。然... 详细信息

化疗耐药是胰腺癌预后不良的重要原因。既往研究表明,ATP结合盒（abc）转运蛋白包括P糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）蛋白可调节多种癌症的耐药;此外,微小RNA（miRNAs）也参与了肿瘤的化疗耐药。然而,abc转运蛋白和miRNAs是否与胰腺癌化疗对吉西他滨的耐药相关以及它们之间的相互调控关系尚不清楚。本研究中,我们研究了abc转运蛋白和miRNAs在胰腺癌中吉西他滨耐药中的潜在机制,发现hsa-miR-3178通过RhoB/PI3K/Akt通路介导的abc转运蛋白促进吉西他滨化疗耐药。我们发现P-gp、BCRP和MRP1在吉西他滨耐药的胰腺癌组织和细胞中高表达。计算机分子对接实验分析显示,吉西他滨可作为底物与abc转运蛋白结合。我们前期研究发现,与亲本PANC-1细胞相比,在吉西他滨耐药的PANC-1细胞（PANC-1-GEM）中hsa-miR-3178表达上调。此外,我们通过CCK-8、EdU、流式细胞术和动物实验发现,hsa-miR-3178能促进胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。生物信息学分析发现RhoB是hsa-miR-3178的下游靶点,Western blotting和双荧光素酶报告实验发现hsa-miR-3178直接靶向RhoB。Rescue实验表明RhoB可以逆转hsa-miR-3178所介导的吉西他滨耐药。且hsa-miR-3178/RhoB可通过激活PI3K/Akt通路,增加abc转运蛋白的表达,促进胰腺癌吉西他滨耐药。综上,我们的研究结果表明,hsa-miR-3178通过RhoB/PI3K/Akt通路介导的abc转运蛋白促进吉西他滨耐药,这可能成为克服吉西他滨耐药的新的治疗靶点。

关键词： Hsa-miR-3178 RhoB PI3K/Akt 胰腺癌吉西他滨耐药 abc转运蛋白

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苏云金芽胞杆菌abc转运蛋白的功能鉴定

苏云金芽胞杆菌ABC转运蛋白的功能鉴定

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作者：林菲菲福建农林大学

学位级别：硕士

abc(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其相距较近的abc基因,命名为abc-1,并克隆绿色荧光蛋白Gfp基因,... 详细信息

abc(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其相距较近的abc基因,命名为abc-1,并克隆绿色荧光蛋白Gfp基因,构建融合表达载体pET32a-Gfp-abc-1,导入大肠杆菌BL21中进行表达。通过细胞破碎将诱导表达后的菌株pET32a-Gfp-abc-1成分分离镜检,并通过SDS-PAGE及膜蛋白提取,证实abc-1转运蛋白在行使功能时是定位于细胞膜上的。利用在线软件对abc-1进行生物信息学结构分析。结构分析中显示α螺旋在abc-1所占的比例最大(47.39%),推测该abc-1蛋白是正向“半分子”的转运模型:NBD-TMD。这些α螺旋聚集在一起,呈现出一个类似的“通道”构象,该结构可能形成了溶质跨膜的通道。预测结果显示该单体是通过形成二聚体的形成来发挥功能蛋白的作用。选取 pET32a、pET32a-Gfp、pET32a-abc-1、pET32a-Gfp-abc-1 四种菌株进行生长曲线的测定,显示在LB培养基中含有abc-1基因菌株的生长量相较与对照菌株提高了170.81%。用蛋白胨和酵母提取物分别作为主要营养物质,生长量分别提高了 58.3%和61.1%。可以推测,abc-1的存在可能更有利于菌株利用营养物质从而提高生长量。在菌株生长有机碳源筛选中,选取4种单糖:葡萄糖、果糖、半乳糖和阿拉伯糖,结果显示abc-1可能并不以糖类作为转运底物。在有机氮源中筛选,选取了4种氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。结果显示abc-1对赖氨酸和精氨酸有较高的亲和性,生长量相较与对照菌株分别提高了19.52%和38.66%。在探究abc-1和几丁质酶可能的功能相关性,选用NAG作为筛选的营养物质进行培养,结果显示abc-1对NAG有很高的亲和性,生长量相较与对照菌株提高了85.3%,表明NAG很有可能是abc-1蛋白的运输底物之一,同时参考abc-1和儿丁质酶的位置关系,abc-1和几丁质酶具有功能相关的可能性进一步的提高。目前国内对于苏云金芽胞杆菌基因组中abc基因进行的功能鉴定,尚未见报道。本研究对于abc-1基因的功能定位以及分子模型的探究对于今后对Bt基因组中其它的abc基因进行分析研究提供了参考,同时对通过改造abc基因进而影响几丁质酶的表达的新思路的可行性提供了借鉴,对提高Bt杀虫活性有重大意义。

关键词： abc转运蛋白苏云金芽胞杆菌 Gfp 底物筛选

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氟康唑和黄芩苷联合对耐氟康唑的白念珠菌abc转运蛋白的影响

氟康唑和黄芩苷联合对耐氟康唑的白念珠菌ABC转运蛋白的影响

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作者：马晓丽昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：1.研究氟康唑和黄芩苷单用以及联合应用对标准菌株、临床分离的对耐氟康敏感菌株和临床分离的对氟康唑耐药的白念珠菌菌株(即白假丝酵母菌)MIC的影响。2.氟康唑和黄芩苷单用与联合应用对白念珠菌耐药株细胞膜上主动外排基因CDR1、... 详细信息

目的：1.研究氟康唑和黄芩苷单用以及联合应用对标准菌株、临床分离的对耐氟康敏感菌株和临床分离的对氟康唑耐药的白念珠菌菌株(即白假丝酵母菌)MIC的影响。2.氟康唑和黄芩苷单用与联合应用对白念珠菌耐药株细胞膜上主动外排基因CDR1、CDR2表达水平(mRNA)的影响以及对基因表达产物abc转运蛋白的影响的研究。方法：1、采用(ATCC)标准白念珠菌菌株和临床分离的对氟康唑敏感和对氟康唑耐药的菌株：通过微量稀释法进行氟康唑、黄芩苷两种药物敏感性实验研究(根据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的M27-A方案);2、采用棋盘式微量稀释法检测黄芩苷与氟康唑联合用药对白念珠菌的抑菌效果,以部分抑菌浓度指数来评价;3、用RT-PCR法检测临床分离敏感菌株、耐药株和标准株的主动外排基因CDR1、CDR2的表达水平(mRNA)。4.采用检测氟康唑和黄芩苷单用和联合应用后标准菌株和临床分离的敏感,耐药菌株的细胞外液中罗丹明6G的浓度,来间接检测abc转运蛋白的外排情况,从而明确abc转运的外排活性的高低,来进一步观察***2基因表达产物abc转运蛋白的表达水平。5.统计学方法采用单侧t检验。结果：1、氟康唑、黄芩苷对白念珠菌标准菌株,临床分离的对氟康唑敏感和耐药菌株的MIC分别为4mg/ml、4μg/ml,2mg/ml、1ug/ml,8mg/ml,64ug/ml;2、氟康唑、黄芩苷联合用药对标准、临床分离的对氟康唑敏感和耐药菌株的MIC分别为0.5mg/ml、1μg/ml, FICI=1/4+0.5/4=0.3750.05),在氟康唑和黄芩苷联用后出现CDR1的表达,而CDR2未见表达;临床分离的敏感菌株在未用药时CDR1低表达,CDR2未见表达,应用氟康唑和黄芩苷单独和联合用药后CDRl表达水平均升高(P0.05);临床分离的耐氟康唑的菌株未用药时见***2的表达,在应用氟康唑和黄芩苷单独处理和两种药物联合处理后均出现CDRl表达水平升高(Pabc转运蛋白的外排功能。***2基因的表达可能于CDRl基因的表达有关。

关键词：黄芩苷氟康唑白假丝酵母菌 CDR1基因 abc转运蛋白罗丹明6G

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油茶abc转运蛋白基因家族的鉴定及其功能解析研究

油茶ABC转运蛋白基因家族的鉴定及其功能解析研究

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作者：余姝姝中南林业科技大学

学位级别：硕士

油茶是我国极具食用价值和经济价值的木本油料树种。油茶属自交不亲和树种,种植时需要进行合理的品种配置。为解析油茶自交不亲和的分子机制,本实验室团队以油茶主要栽培品种‘华鑫’和‘华金’为试验材料,构建了自交和异交授粉后存在... 详细信息

油茶是我国极具食用价值和经济价值的木本油料树种。油茶属自交不亲和树种,种植时需要进行合理的品种配置。为解析油茶自交不亲和的分子机制,本实验室团队以油茶主要栽培品种‘华鑫’和‘华金’为试验材料,构建了自交和异交授粉后存在显著差异的雌蕊转录组数据库。通过转录组解析,发现abc转运蛋白代谢途径与油茶自交不亲和紧密相关,为此,本课题开展了油茶abc转运蛋白的基因克隆及功能研究。取得如下研究结果:1.油茶6条abc转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析。从油茶自交和异交雌蕊转录组数据中筛选得到6条差异显著的abc转运蛋白基因,设计6对特异性引物,扩增并克隆获得具有全长的CDS基因序列;该6个基因的全长CDS序列分别为:3381 bp、2142 bp、2172 bp、1935 bp、2166 bp、3318 bp,分别编码 1126、713、2172、644、721、1105 个氨基酸;相对分子量分别为 126.53、79.63、79.93、72.65、80.47、121.84kDa;等电点 PI 分别是 9.02、5.8、8.84、7.91、80.47、8.9;预测结果显示分别含有13、0、6、6、6、5个跨膜结构。保守结构域分析发现6个基因均含有NBD结构域,包括Walker A基序,abc标签序列和Walker B基序三个特征序列,确认属于abc转运蛋白家族。对上述6个基因分别命名为:CoabcC9、CoabcF3、CoabcG3、CoabcG5、CoabcG11、CoabcG28。2.揭示了油茶6个abc转运基因在不同组织部位和不同时段的表达规律。试验结果表明,各基因在不同组织部位存在明显的表达差异,CoabcC9和CoabcF3基因在老茎和花粉中表达较高,CoabcG3和CoabcG5基因在老茎和芽中表达量较高,CoabcG11基因在花瓣中表达较高,CoabcG28基因在花粉中特异表达。各基因在不同授粉时期的花柱和子房也存在显著的表达差异,CoabcC9、CoabcF3、CoabcG3、CoabcG28基因在授粉 24 或 36 h 时,自交花柱的表达量均高于同时段的异交和未授粉的表达量;CoabcC9、CoabcG3、CoabcG11、CoabcG28基因在36或48 h时,自交子房的表达量均大于同时段的异交和未授粉的表达量。说明这些基因在不同部位和不同时段差异显著,可能参与自交不亲和反应。3.在CoabcF3基因序列克隆的基础上,构建了原核表达载体Pcold-TF-CoabcF3。将其转化至大肠杆菌Ecoli（DE3）表达载体中,成功诱导出蛋白分子量为79.93 kDa的目的蛋白。4.成功构建了 6个基因的亚细胞定位表达载体。观察结果显示:CoabcC9、CoabcG11、CoabcG28基因在细胞膜和叶绿体上均有分布,CoabcG3和CoabcG5基因主要分布在细胞膜上,CoabcF3基因主要分布在线粒体上。5.构建了 CoabcC9、CoabcF3、CoabcG3、CoabcG5、CoabcG11、CoabcG28基因的超表达载体,通过花粉管通道法转化至拟南芥中,成功获得T2代阳性植株。表型观察结果显示:CoabcC9基因超表达植株的根系生长显著长于野生型植株的根系,转基因叶片生长相比野生型拟南芥更为旺盛;CoabcG3基因超表达植株所结果实显著短于野生型拟南芥植株的果实;其他四条基因超表达植株的表型无明显差异。6.采集T2代CoabcC9、CoabcF3、CoabcG28基因超表达植株的花蕾作为实验材料,测定了可溶性糖含量。分析结果显示:CoabcC9基因超表达植株的可溶性糖含量显著高于野生型拟南芥;CoabcF3基因超表达植株的可溶性糖含量显著低于野生型拟南芥;CoabcG28基因超表达植株的可溶性糖含量低于野生型拟南芥。

关键词：油茶 abc转运蛋白克隆表达分析亚细胞定位真核表达

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桔小实蝇abc转运蛋白基因鉴定与表达模式分析

桔小实蝇ABC转运蛋白基因鉴定与表达模式分析

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作者：肖林帆西南大学

学位级别：硕士

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)属于双翅目Dipetera,实蝇Trypetidae,寡鬃实蝇亚科Dacinae,果实蝇属Bactrocera Macquart,是一种重要的果蔬害虫。目前,化学防治仍是防控桔小实蝇的主要手段,但由于长期不合理地大量施用化学药剂,导... 详细信息

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)属于双翅目Dipetera,实蝇Trypetidae,寡鬃实蝇亚科Dacinae,果实蝇属Bactrocera Macquart,是一种重要的果蔬害虫。目前,化学防治仍是防控桔小实蝇的主要手段,但由于长期不合理地大量施用化学药剂,导致桔小实蝇对常用化学药剂产生了较高水平的抗性。腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,abc转运蛋白)作为一种外排泵,是一种可利用三磷酸腺苷(ATP)进而促使物质逆浓度梯度跨膜转运的膜蛋白。abc转运蛋白能够降低胞内外源物质的浓度,从而导致昆虫对药剂的敏感性下降。迄今,对桔小实蝇抗药性机制的研究主要集中于初级代谢和次级代谢,而对转运代谢研究甚少。据此,本学位论文基于桔小实蝇基因组和转录组数据,鉴定桔小实蝇abc转运蛋白基因,并通过定量表达、RNAi等手段解析桔小实蝇abc转运蛋白在杀虫剂转运中的功能,研究结果对于深入阐明桔小实蝇抗药性机制具有重要的意义。本学位论文的主要研究结果如下:基于桔小实蝇基因组和转录组数据,鉴定出47个abc转运蛋白基因。根据各亚家族保守结构域,将47个abc转运蛋白基因分为8个亚家族(A-H),包括7个abcA、7个abcB、9个abcC、2个abcD、1个abcE、3个abcF、15个abcG以及3个abcH亚家族基因。其中,BdabcB2与BdabcG1可能具有选择性剪接现象。基于转录组数据,47个abc转运蛋白基因中有29个具有完整的开放阅读框(ORFs)。ORFs最短为1830 bp,最长为6705 bp,编码610至2235个氨基酸。基于不同物种的abc转运蛋白基因的系统发育分析表明,桔小实蝇abc转运蛋白基因与黑腹果蝇Drosophila melanogaster大部分abc转运蛋白基因具有直系同源关系(保守序列一致性在80%以上),特别是一些与果蝇抗逆性等相关的基因。此外,每个亚家族的abc转运蛋白基因可以聚为一支,且每一分支具有明显的功能聚类。通过不同组织转录组的比较分析,并结合实时荧光定量PCR(qPCR)技术,解析桔小实蝇abc转运蛋白基因的表达模式。结果发现,桔小实蝇abc转运蛋白基因在不同组织间的表达量不同,且大部分abc转运蛋白基因在解毒代谢组织(马氏管、中肠、脂肪体)高表达(表达量为精巢的5倍以上),暗示abc转运蛋白基因可能参与桔小实蝇体内解毒代谢的转运过程。此外,BdabcB7在中枢神经系统特异性高表达,而其同源基因DmMDR65在血脑屏障起调节脑内外源物质的重要作用,因此,推测BdabcB7可能也与调节血脑屏障通透性的功能有关。以3种杀虫剂(马拉硫磷、高效氯氰菊酯和阿维菌素)对桔小实蝇进行胁迫处理,利用qPCR技术分析桔小实蝇18个abc转运蛋白基因响应胁迫的剂量和时间效应。结果显示,低致死剂量处理后(lethal dose(LD),LD与LD),桔小实蝇体内abc转运蛋白基因的表达量无显著性变化;但随着致死剂量的增大,大部分abc转运蛋白基因的表达量逐渐升高,且多数基因在致死中量(LD)胁迫后的表达量达到最高(为对照组6倍以上);且大部分的abc转运蛋白基因的表达量在胁迫48 h达到高峰,而在胁迫72 h开始下调。此外,abc转运蛋白基因可能特异性地响应不同的药剂,如BdabcB7可能与马拉硫磷的代谢相关,BdabcE1可能参与阿维菌素和高效氯氰菊酯的药剂代谢,而BdabcG1可能参与马拉硫磷和阿维菌素的药剂代谢。为了进一步明确abc转运蛋白基因是否参与介导特定药剂的代谢,以BdabcB7为对象,利用RNAi技术抑制BdabcB7基因的表达,结合马拉硫磷毒力测定揭示该基因的功能。结果显示,对桔小实蝇注射BdabcB7基因的dsRNA后,在24 h和48 h的基因沉默效率分别为51%和66%;对注射dsRNA 48 h后的试虫进行马拉硫磷毒力测定,结果显示试虫对马拉硫磷的敏感性显著提高。在相同剂量处理下,目的基因沉默后的试虫死亡率更高(提高22%),且死亡速率显著性加快。说明BdabcB7能够显著影响桔小实蝇对马拉硫磷的解毒代谢能力。综上所述,本学位论文综合利用生物信息学、分子生物学、RNAi以及生物测定等技术,鉴定得到桔小实蝇8个亚家族的47个abc转运蛋白基因。系统发育及表达模式解析结果说明桔小实蝇abc转运蛋白基因在其抵抗药剂胁迫的过程中具有重要作用。BdabcB7可能参与桔小实蝇对马拉硫磷代谢的过程。

关键词：桔小实蝇 abc转运蛋白表达模式分析代谢抗性 RNA干扰

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球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶（Bbaph）与abc转运蛋白（BbT1）的功能分析

球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶（Bbaph）与ABC转运蛋白（BbT1）的...

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作者：赵静浙江大学

学位级别：硕士

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种经典的昆虫病原真菌,在害虫防治中应用广泛。其抗逆分子机理直接关系到生防制剂的田间防效,科学与实践意义重大。本研究开展了对酰基-辅酶A脱氢酶APH结构域即氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph的功能分析... 详细信息

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种经典的昆虫病原真菌,在害虫防治中应用广泛。其抗逆分子机理直接关系到生防制剂的田间防效,科学与实践意义重大。本研究开展了对酰基-辅酶A脱氢酶APH结构域即氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph的功能分析,并对两种昆虫病原真菌中结构相似的abc转运蛋白进行功能分析。主要结果如下：球孢白僵菌Bbaph基因的功能球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph的全长1226bp,含2个外显子和3个内含子,编码366个氨基酸。由Bb2860野生株构建敲除株ΔBbaph和回补株ΔBbaph/Bbaph,进行表型分析。与野生株和回补株相比,ΔBbaph产孢量、耐45℃热胁迫的能力、耐UV-B紫外辐射的能力以及对斜纹夜蛾(Spodoptera litura)二龄幼虫的毒力分别下降92%、37%、27%及21%。敲除株对15-45mM过氧化氢和2-3mM甲萘醌氧化胁迫的抵抗力上升18%～50%,对多菌灵、三环唑、申嗪霉素、嘧菌酯、菌核净等不同类型的化学药物的抗性下降10%--68%。除半乳糖之外,多种碳源和无机氮源都促进敲除株生长,而有机氮源则抑制其生长。野生株与回补株之间无任何表型差异。由此说明,Bbaph基因参与调控球孢白僵菌的产孢、生长及多胁迫抗性。两种昆虫病原真菌中结构相似abc转运蛋白的功能比较球孢白僵菌和玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)均存在一种结构相似的ATP结合匣即abc转运蛋白,分别记为BbTl和IfT1。为了比较这一转运蛋白在两种真菌中的的生物学功能,由Bb2860野生株构建BbTl的敲除株和回补株,并将IfT1在BbTl敲除株中异源重组表达,然后测定各菌株的表型。与野生株、回补株及异源重组株相比,敲除株对20-40mM过氧化氢和2～8mM甲萘醌氧化胁迫的抵抗力下降27%～2.1倍,对多菌灵、伊曲康唑、菌核净、放线菌酮、乙嘧酚和4-硝基喹啉N-氧化物等不同类型化学药物的抗药性下降28%～4.7倍,对斜纹夜蛾二龄幼虫的毒力下降20%左右,而野生株、回补株及异源重组株之间无任何显著的表型差异。结果表明,BbTl和IfT1是结构相似且功能一致的abc转运蛋白,分别是两种生防真菌多药抗性的重要决定因子之一,因参与抗氧化反应而对毒力有所贡献。综上所述,球孢白僵菌酰基-辅酶A脱氢酶APH结构域即氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph和abc转运蛋白都是产孢、生长及抗逆性状的重要调节因子,后者还是多药抗性的决定因子之一。这些结果增添了生防真菌抗逆分子机理的认识。

关键词：球孢白僵菌玫烟色棒束孢酰基-辅酶A脱氢酶氨基糖苷磷酸转移酶产孢生长抗逆性状 abc转运蛋白多药抗性抗氧化毒力

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苦荞abc转运蛋白基因的克隆与功能初步分析

苦荞ABC转运蛋白基因的克隆与功能初步分析

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作者：李洁西北农林科技大学

学位级别：硕士

ATP结合盒(ATP-binding cassette,abc)转运蛋白属于膜整合蛋白超家族,遍布于原核和真核生物中,借助水解ATP得到的能量运输底物分子进出胞内外实现功能。动物中的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是起先得到学者普遍关注的abc转运... 详细信息

ATP结合盒(ATP-binding cassette,abc)转运蛋白属于膜整合蛋白超家族,遍布于原核和真核生物中,借助水解ATP得到的能量运输底物分子进出胞内外实现功能。动物中的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是起先得到学者普遍关注的abc转运蛋白类型。研究证实在植物中,外源物质、植物激素、金属离子、脂类和次级代谢物是abc转运蛋白的主要转运底物。本研究首先对铅处理下苦荞种子萌发实验和盆栽实验中苦荞叶片的生理形态指标进行分析,并依据铅处理环境下的苦荞叶片转录组数据,通过实时定量验证重金属铅处理条件下差异表达abc转运蛋白基因(Ft abcB1、FtabcC9、FtabcG11和FtabcG15)表达特征,通过RT-PCR克隆表达存在差异的苦荞abc转运蛋白基因的开放阅读框,并对基因序列进行生物学分析;构建基于pYES2的酵母表达载体,在重金属敏感酿酒酵母突变菌株ycf1中验证各abc转运蛋白的功能;构建基于pCAMBIA3301的植物表达载体,在拟南芥中进行过量表达,研究为深入阐释abc转运蛋白在苦荞植物重金属富集和解毒中的机理提供基础。本研究得到的主要结论有:(1)在0mg/L-1600mg/L的硝酸铅浓度范围内,铅处理对苦荞种子的发芽率无明显影响;在0g/kg-15g/kg的硝酸铅浓度范围内,铅处理对植株的生长发育无明显影响,但对苦荞萌发期胚根伸长和成株期的株高有抑制作用;铅处理导致苦荞叶片部位游离脯氨酸含量降低,诱导丙二醛含量、可溶性蛋白含量和的可溶性糖含量(还原糖除外)显著增加,随着铅浓度的增加,SOD和CAT活性先升高后降低,这些指标变化表明在一定浓度铅处理下苦荞叶片生物膜系统受到伤害,但苦荞良好的生理基础使其能在低铅浓度下应对胁迫。苦荞生物量大,生长周期短,较好的耐铅性使其成为有潜力可开发的生物修复植物。(2)转录组数据分析显示,FtabcB1、FtabcC9、FtabcG11和FtabcG15在重金属胁迫条件下表达上调;实时定量分析表明FtabcC9、FtabcG11和Ft abcG15均在叶片中表达最高,分别为根的4.9、23.6和3.5倍。而FtabcB1在根、茎和叶中的表达相近。在铅处理下定量分析表明,4个基因在根,茎和叶中均有上调,其中,在硝酸铅为10g/kg土和15g/kg土的处理根中,FtabcC9和FtabcG11上调最多,分别是对照的7.7和3.9倍。而在10g/kg土的硝酸铅处理叶中,FtabcG15和FtabcB1上调最多,分别是对照的6倍、3.7倍,表明不同abc基因组织表达特性及对铅胁迫的响应存在差异。(3)苦荞abc转运蛋白基因FtabcB1、FtabcC9、FtabcG11和FtabcG15的编码序列分别为4047bp、4476bp、2121bp和2061bp,分别编码147.3kDa、166.6kDa、78kDa和76kDa的蛋白。氨基酸分析显示其含有abc转运蛋白典型的WalkerA基序、WalkerB基序以及abc特征基序。跨膜结构分析表明Ft abcB1和FtabcC9为正向全分子abc转运蛋白,FtabcG11和FtabcG15为反向半分子abc转运蛋白。(4)在重金属敏感酿酒酵母ycf1的功能互补显示在初始接菌量相同的条件下,实验组转化pYES2-FtabcB1、pYES2-FtabcG11和pYES2-FtabcG15的酵母生长速度明显较对照组转化空载体pYES2的酵母缓慢。推测abc转运蛋白对酵母产生细胞毒性从而抑制其生长,因而该表达系统可能不适合来验证abc基因的功能。(5)构建融合GFP的植物表达载体,通过洋葱表皮亚细胞定位实验表明FtabcB1、FtabcC9、FtabcG11和FtabcG15可能均位于细胞质膜。分别获得转基因FtabcG11和FtabcB1的T0代、转基因FtabcG15的T2代拟南芥阳性植株,为深入研究苦荞abc转运蛋白基因的重金属抗性功能奠定基础。

关键词： abc转运蛋白苦荞重金属铅胁迫

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响应茉莉酸的核盘菌abc转运蛋白SS1G＿13659功能研究

响应茉莉酸的核盘菌ABC转运蛋白SS1G＿13659功能研究

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作者：孙睿华中农业大学

学位级别：硕士

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种重要的植物病原真菌,其引起的油菜菌核病每年造成重大经济和产量损失,严重制约我国油料作物的发展。核盘菌致病机理复杂,深入研究其发病机制有利于为菌核病的防治提供参考。核盘菌... 详细信息

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种重要的植物病原真菌,其引起的油菜菌核病每年造成重大经济和产量损失,严重制约我国油料作物的发展。核盘菌致病机理复杂,深入研究其发病机制有利于为菌核病的防治提供参考。核盘菌是典型的死体营养型病原真菌,植物激素茉莉酸与植物抗病密切相关,研究表明茉莉酸信号通路在植物抵抗死体营养型病原物过程中发挥重要作用。本实验室前期通过转录组数据筛选核盘菌响应茉莉酸处理的高表达基因,发现其中SS1G＿13659显著上调表达。SS1G＿13659基因全长4381 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码1439个氨基酸的abc转运蛋白,有13个跨膜结构域,属于abcG亚家族。利用Split-Marker和同源重组技术对SS1G＿13659基因进行了敲除,通过诱导子囊盘萌发和弹射子囊孢子,筛选获得2个纯合转化子ΔSS1G＿13659-4和ΔSS1G＿13659-5。对SS1G＿13659敲除转化子进行生物学表型试验,结果表明SS1G＿13659基因不参与核盘菌的菌丝生长、菌核形成、产酸及侵染垫形成等过程,但敲除转化子在野生型拟南芥和油菜叶片上的致病力与野生型菌株相比明显降低。有意思的是,敲除突变体与野生型菌株1980在接种拟南芥茉莉酸合成突变体opcl上的致病力无明显差异,结果提示SS1G＿13659蛋白可能与核盘菌对植物茉莉酸的抗性相关。研究结果有助于我们进一步理解核盘菌的致病机制及茉莉酸在植物抗性中的作用,并有可能为菌核病防控提供新的思路和靶标。

关键词：核盘菌茉莉酸 abc转运蛋白植物抗性致病机理

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