检索结果-南通市图书馆

华中科技大学学报（医学版） 2022年第6期51卷 825-829页

作者：曹淳陈耀何佳佳张毛雪钱正韬周小明江苏大学医学院基础医学与医学技术学院镇江212013

目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组aavs1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技... 详细信息

目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组aavs1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技术构建aavs1-all-in-one-CRISPR质粒。利用脂质体将识别并切割aavs1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及aavs1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入aavs1安全港的稳定细胞株。继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组aavs1位点。经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的aavs1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因。

关键词： aavs1 CRISPR ZFN TALEN 基因编辑

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

人细胞中CRISPR/Cas9介导的aavs1位点可诱导型Cas9表达盒的插入

人细胞中CRISPR/Cas9介导的AAVS1位点可诱导型Cas9表达盒的插入

引用

作者：宋洋福建师范大学

学位级别：硕士

aavs1位点是位于人类基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列,在该位点中敲入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。近几年来,出现一种新的基因编辑的技术CRISPR/Cas9,该技术进行基因编辑时需要在细胞内表达一个160k... 详细信息

aavs1位点是位于人类基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列,在该位点中敲入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。近几年来,出现一种新的基因编辑的技术CRISPR/Cas9,该技术进行基因编辑时需要在细胞内表达一个160kd的Cas9蛋白和很小片段sgRNA,目前主要通过瞬时表达载体在细胞内表达Cas9蛋白和sgRNA,由于在一些细胞中导入钱体效率不高而影响切割效率,而如果在人细胞的aavs1位点插入一个可诱导型表达Cas9蛋白的表达盒,通过诱导,可在细胞内先表达Cas9蛋白,再通过转染的方式导入小片段的sgRNA即能大大提高切割效率,并且可同时导入多个sgRNA进行多基因的同时编辑。并且可诱导的Cas9蛋白的表达也避免了持续表达的Cas9蛋白在细胞内长期表达,对细胞有毒性,容易造成实验误差的影响。本课题拟尝试利用CR1SPR/Cas9技术在人细胞的aavs1位点中插入可诱导型Cas9的表达盒。首先,本实验针对在aavs1位构建了质粒LentiCRISPRv2-sgRNA1/2/3,检测其切割效率分别为22%、25%和27%,并检测发现LentiCRISPRv2-sgRNA2/3在其潜在脱靶位点上不存在脱靶效应。其次,利用LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒和AAV-CAGGS-EGFP donor质粒进行了HEK293T和人牙胚间充质永生化细胞的aavs1位点的敲入外源基因EGFP的实验。结果表明LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒与AAV-CAGGS-EGFP doner质粒可以实现在这两种细胞的aavs1位点中插入EGFP表达元件,并且插入效率差异不大。最后,利用LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒以及可诱导型Cas9的表达盒的组件：Puro-Cas9 donor和Neo-M2rtTA donor质粒进行了HEK293T细胞的aavs1位点上插入可诱导型Cas9表达盒的实验。蛋白质印记的结果显示可以在人的细胞中插入可诱导型Cas9表达盒。

关键词： aavs1 CRISPR/Cas9 可诱导型Cas9

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

雷帕霉素介导的caspase 9同源二聚化调控人类多能干细胞自杀

引用

生物工程学报 2023年第10期39卷 4098-4107页

作者：杨洋刘洋陈敏李双鹏鹿璇贺瑜张焜邹庆剑广东工业大学生物医药学院广东广州510006 五邑大学生物科技与大健康学院、广东省医学大动物模型重点实验室广东江门529020 中国科学技术大学生命科学学院安徽合肥230026 江门中心医院国家药物临床试验机构广东江门529000

人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在再生医学领域具有广阔的应用前景。然而,多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)具有肿瘤化风险,成为其临床应用最主要的安全性问题。雷帕霉素是一种安全和广泛使用... 详细信息

人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在再生医学领域具有广阔的应用前景。然而,多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)具有肿瘤化风险,成为其临床应用最主要的安全性问题。雷帕霉素是一种安全和广泛使用的免疫抑制药物,通过诱导FKBP12与FRB片段的异源二聚起作用。为了保障hiPSCs治疗的安全性,本研究将雷帕霉素诱导的caspase 9(riC9)基因插入到aavs1安全位点,构建了含有EF1α启动子、FRB-FKBP-Caspase9(CARD结构域)融合蛋白和嘌呤霉素抗性基因的供体,并与sgRNA/Cas9载体共转染hiPSCs。用嘌呤霉素筛选2周后,收集单个克隆进行基因和表型分析。最后,用雷帕霉素诱导caspase9同源二聚化,激活工程细胞的凋亡。通过对筛选获得的5个hiPSCs克隆鉴定,表明供体DNA准确敲入内源性aavs1位点。hiPSCs保持正常的多潜能状态和增殖能力。雷帕霉素可诱导caspase9同源二聚化,并激活细胞凋亡程序。本研究通过药物精确调控caspase9的同源二聚化来启动细胞自杀,实现了可控的hiPSCs存活,这为保证hiPSCs治疗的安全性提供了新的策略。

关键词：诱导多能干细胞 aavs1 caspase 9 雷帕霉素同源二聚化

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系

应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系

引用

作者：马新宇内蒙古科技大学包头医学院

学位级别：硕士

目的本研究旨在采用CRISPR/Cas9系统建立IGR-IIR基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞的影响及曲妥珠单抗耐药性机制提供细胞模型。方法根据aavs1基因序列设计并合成6对sg RNA,使用UCACRISPR/Cas9快速构建及... 详细信息

目的本研究旨在采用CRISPR/Cas9系统建立IGR-IIR基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞的影响及曲妥珠单抗耐药性机制提供细胞模型。方法根据aavs1基因序列设计并合成6对sg RNA,使用UCACRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与p CS载体连接,筛选效率最高的sg RNA构建Cas9/sg RNA表达载体;用Asi SI+Bstz17I酶切将IGF-IIR片段连入h aavs1-KI载体中,构建IGF-IIR打靶载体,Eco RI+Sca I、Nco I、Bgl II酶切鉴定并测序验证;采用流式细胞技术确定电转染最佳条件,将Cas9/sg RNA载体和IGF-IIR打靶载体以最适电转条件共同转染SKBR3细胞;使用不同浓度嘌呤霉素处理SKBR3,以7天杀死全部细胞为标准,确定最佳筛选浓度后进行筛选,将混合细胞提取基因组,进行PCR鉴定并测序检测,构建IGF-IIR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体培养基法及有限稀释法进行单克隆制备。结果成功构建作用于aavs1位点靶序列的Cas9/sg RNA载体,sg RNA活性检测显示,sg RNA2较sg RNA1、sg RNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-IIR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200v、20ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/m L;IGF-IIR打靶载体以及p CS-sg RNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确;单克隆细胞因细胞状态差、逐渐凋亡,IGF-IIR过表达在体外抑制了SKBR3的生长。结论成功获得IGF-IIR基因在aavs1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定基础。

关键词：胰岛素生长因子受体2 HER-2阳性乳腺癌 CRISPR/Cas9技术基因敲入 aavs1

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系

引用

生物技术通讯 2020年第3期31卷 297-304页

作者：马新宇王潇曹中伟内蒙古自治区人民医院甲乳疝外科内蒙古呼和浩特010010 内蒙古自治区人民医院科研处内蒙古呼和浩特010010

目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据aavs1基因序列设计并合成6对小... 详细信息

目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据aavs1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用Asi SⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入haavs1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,Eco RⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆。结果:构建了作用于aavs1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于aavs1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确。结论:获得IGF-ⅡR基因在aavs1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础。

关键词：胰岛素样生长因子受体2 HER-2阳性乳腺癌 CRISPR/Cas9技术基因敲入 aavs1

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：