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PTEN knockdown with the Y444F mutant aav2 vector promotes axonal regeneration in the adult optic nerve

Neural Regeneration Research 2018年第1期13卷 135-144页

作者： Zheng-ru Huang Hai-ying Chen Zi-zhong Hu Ping Xie Qing-huai Liu Department of Ophthalmology the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University Nanjing Jiangsu Province China Department of Ophthalmology the Second People's Hospital of Changshu Changshu Jiangsu Province China

The lack of axonal regeneration is the major cause of vision loss after optic nerve injury in adult mammals. Activating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway has been shown to enhance the intrinsic growth capacity of neurons and to facilitate axonal regeneration in the central nervous system after injury. The deletion of the mTOR negative regulator phosphatase and tensin homolog （PTEN） enhances regeneration of adult corticospinal neurons and ganglion cells. In the present study, we used a tyrosine-mutated （Y444F） aav2 vector to efficiently express a short hairpin RNA （shRNA） for silencing PTEN expression in retinal ganglion cells. We evaluated cell survival and axonal regeneration in a rat model of optic nerve axotomy. The rats received an intravitreal injection of wildtype aav2 or Y444F mutant aav2 （both carrying shRNA to PTEN） 4 weeks before optic nerve axotomy. Compared with the wildtype aav2 vector, the Y444F mutant aav2 vector enhanced retinal ganglia cell survival and stimulated axonal regeneration to a greater extent 6 weeks after axotomy. Moreover,post-axotomy injection of the Y444F aav2 vector expressing the shRNA to PTEN rescued ～19% of retinal ganglion cells and induced axons to regenerate near to the optic chiasm. Taken together, our results demonstrate that PTEN knockdown with the Y444F aav2 vector promotes retinal ganglion cell survival and stimulates long-distance axonal regeneration after optic nerve axotomy. Therefore, the Y444F aav2 vector might be a promising gene therapy tool for treating optic nerve injury.

关键词： nerve regeneration optic nerve axotomy gene therapy Müller cell retinal ganglion cell aav2 shRNA PTEN GLAST mTOR neural regeneration

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Protection of Mice from Lethal Endotoxemia by Chimeric Human BPI-Fcγ1 Gene Delivery

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Cellular & Molecular Immunology 2006年第3期3卷 221-225页

作者： Chen Li Jing Li Zhe Lv Xinghua Guo Qinghua Chen Qingli Kong Yunqing An Department of Microbiology ＆ Immunology Capital University of Medical Sciences Beijing China China Rehabilitation Research Center Institue of Basic Medical Sciences Beijing 100077 China

To evaluate the potentiality of applying gene therapy to endotoxemia in high-risk patients, we investigated the effects of transferring an adeno-associated virus serotype 2 （aav2）-mediated BPI-Fcγ1 gene on protecting mice from challenge of lethal endotoxin. The chimeric BPI-Fcγ1 gene consists of two parts, one encods functional N-terminus （1 to 199 amino acidic residues） of human BPI, which is a bactericidal/permeability-increasing protein, and the other encodes Fc segment of human immunoglobulin G1 （Fcγ1）. Our results indicated that the target protein could be expressed and secreted into the serum of the gene-transferred mice. After lethal endotoxin challenge, the levels of endotoxin and TNF-a in the gene-transferred mice were decreased. The survival rate of the BPI-Fcγ1 gene-transferred mice was markedly increased. Our data suggest that aav2-mediated chimeric BPI-Fcγ1 gene delivery can potentially be used clinically for the protection and treatment of endotoxemia and endotoxic shock in high-risk individuals. Cellular ＆ Molecular Immunology. 2006;3（3）：221-225.

关键词： BPI-Fcγ1 aav2 gene therapy minimal lethal dose （MLD）

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东北农业大学学报 2020年第6期51卷 70-78页

作者：马兴红张其法姜南李世杰王一妹东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

研究构建稳定表达Plekhs1 shRNA 2型重组腺相关病毒载体(raav2-GFP-shRNA-Plekhs1),筛选并制备抑制Plekhs1表达效果最强重组腺相关病毒(raav2-PL3)。重组病毒子宫角注射到小鼠子宫,通过Real-time PCR、荧光检测、免疫组化技术检测raav2-... 详细信息

研究构建稳定表达Plekhs1 shRNA 2型重组腺相关病毒载体(raav2-GFP-shRNA-Plekhs1),筛选并制备抑制Plekhs1表达效果最强重组腺相关病毒(raav2-PL3)。重组病毒子宫角注射到小鼠子宫,通过Real-time PCR、荧光检测、免疫组化技术检测raav2-PL3在小鼠子宫侵染表达规律,分析raav2-PL3侵染小鼠子宫抑制Plekhs1表达效果及对生殖影响。结果表明,raav2-PL3可有效转染至小鼠子宫内膜上皮细胞中并抑制Plekhs1表达,F1代产仔数量显著降低。研究表明,子宫角注射重组腺相关病毒可高效研究子宫腔上皮基因功能。

关键词： aav2 基因转导生殖发育小鼠子宫

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aav介导的PTEN-Long蛋白表达对脑胶质瘤的抑制作用

AAV介导的PTEN-Long蛋白表达对脑胶质瘤的抑制作用

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作者：林遥河南大学

学位级别：硕士

PTEN是一个广为人知的明星分子,它与抑癌基因TP53一样是一个肿瘤抑制因子。PTEN是一种磷酸酶,具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的双重特性,其脂质磷酸酶活性能够抑制肿瘤发生发展,得到了人们的深入研究。PTEN主要参与PI3K/Akt/mTOR信号通路,... 详细信息

PTEN是一个广为人知的明星分子,它与抑癌基因TP53一样是一个肿瘤抑制因子。PTEN是一种磷酸酶,具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的双重特性,其脂质磷酸酶活性能够抑制肿瘤发生发展,得到了人们的深入研究。PTEN主要参与PI3K/Akt/mTOR信号通路,其脂质磷酸酶活性可以使PIP3去磷酸化成PIP2,从而减少AKT的活化来阻断该信号通路,抑制肿瘤细胞的恶性增殖。随着研究的深入发展,人们发现了许多区别于经典PTEN的翻译变异体,并命名为PTEN-L,PTEN-M,PTEN-N,PTEN-O等,这些区别于经典PTEN分子的翻译变异体,都是从PTEN的起始密码子ATG上游的某个非经典起始密码子开始起始翻译的,它们翻译出来的产物都比经典的PTEN分子要长,其中PTEN-L（PTEN-Long）分子不但拥有与PTEN相似的抑癌功能而且还具有分泌的特性,受到了人们的关注。PTEN-Long可分泌出细胞进入血液、再循环到远端的组织器官后还可以再次进入细胞,这一特性使其具有类似于远程调控作用于肿瘤细胞的作用。理论上,我们可以利用人源的PTEN-Long蛋白直接进行静脉给药,并且能够进入几乎所有的目标细胞,对于肿瘤的治疗具有独特优势。由PI3K、Akt、mTOR三个主要因子组成的PI3K/Akt/mTOR信号通路,能够调节细胞的增殖、分化、黏附和运动的作用。有关研究表明在胶质瘤干细胞（GSCs）中,该条信号通路的活性显著增高,这是GSCs维持自我更新能力和促进其迁移侵袭的关键,而对于神经胶质瘤治疗的前提是治疗药物能够穿过血脑屏障。基因治疗的载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用,其中腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,aav）载体具有低致病性、对宿主抗原性弱、长期稳定表达、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点,是目前发展较快,也是比较有希望用于临床基因治疗的载体之一,已被广泛应用于临床研究。根据aav的不同血清型的组织亲嗜性,其中aav2对中枢神经系统具有组织亲嗜性,能够携带目的基因进入颅内。鉴于此,我们利用aav2携带PTEN-Long基因,构建重组的aav2病毒,用于脑胶质瘤治疗的研究,以期对恶性神经胶质瘤的临床治疗提供参考。本文利用aav2-PTEN-Long重组病毒载体,在细胞水平和个体水平上,研究PTEN-Long的抗肿瘤效果,分析重组aav病毒对神经胶质瘤的抑制作用,探讨其在神经胶质瘤的临床治疗方面的潜在价值。首先在分子水平上克隆目的基因,成功构建真核表达载体后包装aav病毒。在PTEN表达缺陷的U87MG,LNZ-308和A172神经胶质瘤细胞系上过表达PTEN-Long,在蛋白水平上利用WB检测AKT、mTOR等PTEN下游分子是否有活性变化;进而在细胞水平上检测PTEN-Long对U87MG细胞的迁移、侵袭、周期、凋亡、增殖及成瘤能力的影响。然后在个体水平上分析PTEN-Long的抗肿瘤效果,建立裸鼠的皮下及颅内荷瘤模型,通过腹腔、尾静脉注射aav病毒,观察肿瘤的大小,检测PTEN-Long对胶质瘤的抑制作用。综上所述,我们成功包装出了过表达PTEN-Long的aav2病毒;利用包装出来的raav2去感染U87MG、A172和LNZ-308细胞且均能过表达PTEN-Long,在细胞水平上过表达PTEN-Long以后抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进了肿瘤细胞的凋亡。在个体水平上注射raav2也同样能够显著地抑制肿瘤的生长。并且raav2能够携带PTEN-Long穿过血脑屏障,并抑制神经胶质瘤U87MG的生长,迁移和侵袭

关键词： PTEN-Long aav2 神经胶质瘤基因治疗

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抗肿瘤生物治疗药物aav2-TRAIL在荷瘤小鼠体内生物分布研究

抗肿瘤生物治疗药物AAV2-TRAIL在荷瘤小鼠体内生物分布研究

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2010年中国药学大会暨第十届中国药师周

作者：王欣周晓冰苗玉发姜华沈连忠李波刘彦信史娟郑德先中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心中国医学科学院基础医学研究所

目的关于aav2载体介导TRAIL基因在BALB/c荷瘤鼠模型的生物分布研究。方法采用实时定量PCR技术,结合外标绝对定量方法进行。选择小鼠β-actin基因作为内参,分别对目的基因和内参基因设计引物和探针,分别测定各脏器组织样本中目的基因和... 详细信息

目的关于aav2载体介导TRAIL基因在BALB/c荷瘤鼠模型的生物分布研究。方法采用实时定量PCR技术,结合外标绝对定量方法进行。选择小鼠β-actin基因作为内参,分别对目的基因和内参基因设计引物和探针,分别测定各脏器组织样本中目的基因和内参基因的拷贝数。根据公式计算转换后,计算每只小鼠组织DNA中药物分布的拷贝数。考察该药物可以分布到达机体哪些组织器官,以及伴随着给药后时间延长的代谢消除情况。结果该药物主要分布在脾脏、肝脏、肿瘤组织和血液中,一些动物在肠系膜淋巴结、肺和骨髓中有少量分布,在其它脏器没有分布。随着给药后时间的延长,药物在体内逐渐被代谢消除掉,不会在体内长期蓄积。结论该药物在生殖系统和重要的生理器官都无分布,不会产生生殖遗传毒性和广泛的全身毒性反应。因此,推测该药物可以在临床上安全使用。

关键词：腺相关病毒 aav2 TRAIL基因实时定量PCR MGB探针

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抗肿瘤生物治疗药物aav2-TRAIL在荷瘤小鼠体内生物分布研究

抗肿瘤生物治疗药物AAV2-TRAIL在荷瘤小鼠体内生物分布研究

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2009年中国药学大会暨第九届中国药师周

作者：王欣周晓冰苗玉发姜华沈连忠李波刘彦信史娟郑德先中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心中国医学科学院基础医学研究所

关键词：腺相关病毒 aav2 TRAIL基因实时定量PCR MGB探针

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