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Rps14调控内耳干细胞增殖与分化为毛细胞的研究

Rps14调控内耳干细胞增殖与分化为毛细胞的研究

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作者：胡晓婕东南大学

学位级别：硕士

感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss,SNHL)是内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。据相关数据表明,我国绝大多数听力障碍患者均为感音神经性耳聋,其常见病因多为耳蜗部位出现病变。由于人类毛细... 详细信息

感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss,SNHL)是内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。据相关数据表明,我国绝大多数听力障碍患者均为感音神经性耳聋,其常见病因多为耳蜗部位出现病变。由于人类毛细胞无法再生,毛细胞的损伤不可逆,因此感音神经性耳聋在临床上尚无有效的治疗方法。临床上常用的助听装置、人工耳蜗等治疗效果受耳蜗和听觉传入通路的严重程度和类型的限制,因此这些设备的应用具有一定局限性。内耳干细胞的发现使毛细胞再生成为了可能。干细胞具有自我更新和分化潜能,包括胚胎干细胞和成体干细胞。研究表明,内耳中的Lgr5阳性支持细胞具有内耳干细胞的特性,在损伤条件下可以再生具有一定功能的毛细胞。Lgr5阳性支持细胞分化为毛细胞的过程受多种信号通路调控如常见的经典Wnt、Notch信号通路。尽管如此,再生的毛细胞仍然不具有成熟毛细胞的结构与生理功能。因此,揭示毛细胞发育与分化的过程,筛选新的调控内耳干细胞分化为毛细胞的新基因,对功能性毛细胞再生至关重要。前期我们研究了Lgr5阳性支持细胞与Lgr5阴性支持细胞表达谱的差异,筛选发现Rps14可能具有促进内耳干细胞增殖和分化为毛细胞的潜力。因此,本研究利用靶向内耳干细胞的腺相关病毒aav-ie,在体外培养的新生鼠内耳干细胞中过表达Rps14后,在二维培养条件下,显著促进了内耳干细胞的增殖。在三维培养条件下,过表达Rps14能够促进来自内耳类器官中干细胞的增殖和毛细胞的分化。同样,在小鼠耳蜗内,我们利用aav-ie-Rps14感染支持细胞后,细胞的增殖能力得到提升,同时更多的细胞转分化形成新生毛细胞。机制上,为了确定Rps14调控内耳干细胞细胞增殖和分化的信号通路,我们利用RNA-Seq分析比较了aav-ie-Rps14过表达的内耳干细胞和阴性对照组细胞的差异表达基因,获得了Rps14基因关联的信号通路及可能发生相互作用的蛋白质。Rps14主要是通过激活Wnt信号通路,调控一些细胞周期因子来促进内耳干细胞增殖,如Id3,通过抑制Notch,激活TGF-β信号通路生成新的毛细胞。综上,我们发现过表Rps14能够有效调控内耳干细胞的增殖和毛细胞的分化。研究结果将为临床上以aav为载体,通过基因治疗恢复听觉功能奠定理论和临床应用基础。

关键词：感音神经性耳聋内耳干细胞毛细胞 Rps14 aav-ie

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Espin对Atoh1过表达耳蜗上皮中静纤毛再生和保护的作用研究

Espin对Atoh1过表达耳蜗上皮中静纤毛再生和保护的作用研究

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作者：杨雪纯华南理工大学

学位级别：硕士

研究背景据世界卫生组织(WHO)统计,到2050年预计将近25亿人有不同程度的听力损失,至少7亿人需要听力康复治疗,因此寻找有效的治疗方法迫在眉睫。在哺乳动物中,毛细胞(HC)的丢失可导致永久性感音神经性听力损失,这一过程是不可逆转的,因... 详细信息

研究背景据世界卫生组织(WHO)统计,到2050年预计将近25亿人有不同程度的听力损失,至少7亿人需要听力康复治疗,因此寻找有效的治疗方法迫在眉睫。在哺乳动物中,毛细胞(HC)的丢失可导致永久性感音神经性听力损失,这一过程是不可逆转的,因为HC不能在成熟的耳蜗中自发再生。相比之下,非哺乳动物脊椎动物的HC在受损后可以通过触发相邻支持细胞(SC)的转分化而再生,重建相关的听力和前庭功能。因此,众多科研团队考虑通过类似的模式使耳聋的哺乳动物恢复听力。已有研究表明,在哺乳动物中调控转录因子和/或信号通路可以诱导SCs转分化为HCs,这为听力损失的治疗带来了巨大的希望。基因治疗已被证明是可应用于临床的有效工具,不仅能将有益的基因表达引入各种组织,还可以对某些突变的基因位点进行编辑。最近通过aav介导基因来治疗遗传性内耳疾病方面已取得了巨大的进步,因此通过基因疗法再生HC从而恢复听力的前景是非常广阔的。Atoh1过表达可促进出生后耳蜗中的HCs再生,但再生的HCs不具备原位HCs的成熟结构和功能特征。其中静纤毛作为声音传导的一级结构,功能性静纤毛的再生是治疗后恢复听力的关键基础。而Espin是一种肌动蛋白捆绑蛋白,在静纤毛的发育和结构维持中起着重要作用。已有研究发现联合调控多个基因可以使再生HCs成熟化,因此我们考虑将Atoh1与Espin协同调控是否会让再生HCs的结构和功能更加成熟。这样不仅为诱导再生HCs中静纤毛成熟创建了有效的方法,又为SCs转分化为功能性HCs铺平了道路。研究目的1.研究Espin过表达对于Atoh1诱导再生毛细胞表面静纤毛的影响作用。2.探讨Espin过表达能否挽救Atoh1持续过表达对原位毛细胞静纤毛的损伤作用。研究方法1.通过质粒转染、体外干细胞成球以及外植体培养实验,验证体外环境下Espin过表达对毛细胞纤毛的促增长作用;2.利用免疫荧光染色及生物扫描电镜显示再生毛细胞及原位毛细胞的静纤毛形态对比情况,然后通过苯乙烯基染料(FM1-43)摄取荧光强度比较静纤毛的功能状态,以此来探讨双基因协同调控的效果。研究结果1.在HEK293T细胞、类器官以及外植体培养中,Espin过表达促进了纤毛的形成和增长;***和SEM的统计结果均显示aav-AE组再生HCs静纤毛的形态更规则,接近原位HCs的形态。此外,FM1-43摄取实验证明aav-AE组再生HCs静纤毛的摄取功能更强,即生理功能更成熟;***1的长期过表达对HCs会造成较大的损伤,Espin和Atoh1共同过表达时原位IHCs静纤毛的形态更规律。此外,FM1-43摄取实验指示aav-AE组原位IHCs的静纤毛生理功能更强。研究结论***在体外过表达促进毛细胞纤毛的形成和增长;***过表达可以促进Atoh1诱导再生毛细胞的静纤毛形态和功能成熟;***1在原位和再生毛细胞中持续性过表达会导致静纤毛严重受损,但上调Espin能够减轻Atoh1持续过表达对原位内毛细胞和再生毛细胞静纤毛造成的损伤。

关键词：毛细胞再生静纤毛 aav-ie Espin Atoh1

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