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国际输血及血液学杂志 2014年第4期37卷 337-342页

作者：周俊曹江孟凡静冯浩潘秀英吴庆运陈翀牛铭山徐开林江苏省徐州医学院附属医院血液科 221002

目的体外构建抗凋亡转录因子（aatf）-che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-aatf-che1,优化pGEX-4T-1-aatf-che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白.方法采用聚合酶链反应（PCR）法从pGEX-... 详细信息

目的体外构建抗凋亡转录因子（aatf）-che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-aatf-che1,优化pGEX-4T-1-aatf-che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白.方法采用聚合酶链反应（PCR）法从pGEX-4T-1-aatf重组质粒扩增出aatf-che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接aatf-che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白aatf-che1原核表达质粒pGEX-4T-1-aatf-che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白aatf-che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记（WB）法鉴定获得的纯化蛋白.结果原核表达质粒pGEX-4T-1-aatf-che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即aatf-che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得aatf-che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论体外成功构建aatf-che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-aatf-che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究aatf-che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础.

关键词： aatf-che1超家族结构域原核表达融合蛋白纯化

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