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作者：吴庭枫苏州大学

学位级别：硕士

目的探索a2b5/CD133与CD133/a2b5胶质瘤干细胞球的表型特点及其移植瘤病理，明确两类胶质瘤干细胞(GSCs)生物学特性的异同。方法使用神经干细胞培养基(NSCM)培养人脑胶质瘤细胞SHG-139及SHG-44，获取其胶质瘤干细胞球，二次球体形成试... 详细信息

目的探索a2b5/CD133与CD133/a2b5胶质瘤干细胞球的表型特点及其移植瘤病理，明确两类胶质瘤干细胞(GSCs)生物学特性的异同。方法使用神经干细胞培养基(NSCM)培养人脑胶质瘤细胞SHG-139及SHG-44，获取其胶质瘤干细胞球，二次球体形成试验验证自我更新能力;纯化培养后行细胞免疫(ICC)荧光染色检测其CD133、a2b5、Nestin、Vimentin、VEGFR-2、IDH1、 NG2表达情况;含血清培养基诱导其分化，行ICC检测其GFAP，β-IIITubulin，GalC表达情况，验证多向分化能力;表达谱基因芯片明确SHG-139胶质瘤干细胞球及其分化细胞的差异表达基因及关键通路;建立两类胶质瘤干细胞球的裸鼠颅内原位移植瘤模型，免疫组织化学检测CD133、a2b5、Nestin、GFAP、S-100、VEGFR-2、CD31、CD34表达情况，对照分析两类原位移植瘤的病理特点。结果使用神经干细胞培养法成功获取SHG-139与SHG-44的胶质瘤干细胞球，分别命名为SHG-139s及SHG-44s;二次球体形成试验验证两者都具有自我更新能力;ICC染色证实SHG-139s表达a2b5/CD133，SHG-44s表达CD133/a2b5，两者均表达Nestin阳性，而两者表达Vimentin、VEGFR-2、IDH1、NG2存在差异。含血清培养基诱导分化后，ICC证实两类GSCs均具有多向分化能力，而分化后的SHG-139s表达少枝胶质细胞标记物GalC高于分化后的SHG-44s，后者表达神经元早期标记物β-III Tubulin高于前者;基因芯片明确SHG-139s及其分化细胞的差异表达基因与干性维持及侵袭能力密切相关，MAPK通路、TGF-beta通路及细胞粘附功能相关通路为关键差异通路;成功建立了两类细胞的原位移植瘤模型，发现SHG-139s原位移植瘤含有少枝胶质细胞瘤成分，而SHG-44s原位移植瘤未发现该类病理改变;免疫组化提示两者均表达GFAP，S-100阳性;而GSCs标记物在移植瘤内表达低，SHG-139s移植瘤中a2b5+肿瘤细胞具有侵袭能力;SHG-44s颅内原位移植瘤较SHG-44的颅内原位移植瘤表现出更强的局部浸润能力;SHG-44s移植瘤中发现特异性抗人CD34阳性的围成管状的胶质瘤细胞，而SHG-139s未发现该类细胞。结论a2b5/CD133与CD133/a2b5胶质瘤干细胞球均具备胶质瘤干细胞自我更新、多向分化及高致瘤性等特点，然而在分子表型特点、分化倾向及移植瘤病理上两者体现出不同的生物学特性，本实验从胶质瘤干细胞的角度揭示了胶质瘤的异质性特点;使用基因芯片技术结合生物信息学分析明确了a2b5/CD133的GSCs干性维持及侵袭能力的关键基因及通路，为进一步研究靶向该类GSCs的治疗提供了实验依据。

关键词：胶质瘤干细胞胶质瘤 a2b5 颅内移植瘤

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ST8SIA3在胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的作用

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中国微侵袭神经外科杂志 2024年第07期28卷 424-430页

作者：邓知通赵朝辉蔡勇钟兴明汪一棋阳建国费振海张磊顾华杨涛湖州师范学院附属第一医院神经外科

目的探讨ST8α-乙酰神经氨酸酶α-2,8-唾液酸转移酶3（ST8SIA3）对胶质瘤产生耐替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）特性的影响。方法将胶质母细胞瘤细胞株U87-MG进行慢病毒转染，分为对照组、下调组（ST8SIA3表达下调）、过表达组（ST8SIA... 详细信息

目的探讨ST8α-乙酰神经氨酸酶α-2,8-唾液酸转移酶3（ST8SIA3）对胶质瘤产生耐替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）特性的影响。方法将胶质母细胞瘤细胞株U87-MG进行慢病毒转染，分为对照组、下调组（ST8SIA3表达下调）、过表达组（ST8SIA3过表达），使用qRT-PCR检测3组ST8SIA3相对表达，通过Western-blot检测3组a2b5表达与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferese,MGMT）表达。采用不同TMZ浓度（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）与3组细胞培养48h后，使用CCK-8检测并绘制TMZ浓度-细胞生存率曲线。通过单细胞成球实验观察下调组和过表达组ST8SIA3对胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSC）自我更新能力及干细胞标志物（CD133、SOX2）的影响。采用TCGA及CGGA数据库的人脑胶质瘤临床数据，分析ST8SIA3表达与患者预后关系。裸鼠种瘤后记录裸鼠出现恶病质的时间并进行生存分析统计，免疫组织化学方法检测裸鼠原位移植瘤标本MGMT和a2b5表达。结果过表达组a2b5和MGMT相对表达增加。CCK-8实验结果显示：随着ST8SIA3表达增加，TMZ的LC50（半致死浓度）逐渐升高。单细胞成球实验显示：随着ST8SIA3表达增高，成球细胞数量及体积逐渐增加。裸鼠原位移植瘤模型结果显示：过表达ST8SIA3明显缩短裸鼠生存期；随着ST8SIA3表达增加，Ki-67、a2b5、MGMT表达随之增加。结论 ST8SIA3通过合成干细胞标志物a2b5从而促进U87-MG细胞成球能力，进而表现出GSC耐TMZ特性。

关键词：神经胶质瘤胶质瘤干细胞替莫唑胺耐药性 ST8SIA3 a2b5

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建立人源a2b5+/CD133-的胶质瘤干细胞株的实验研究

建立人源A2B5+/CD133-的胶质瘤干细胞株的实验研究

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作者：汪庆玥苏州大学

学位级别：硕士

一、背景和目的脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的肿瘤,胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,五年生存率大约于9.8%。近年来,胶质瘤干细胞(GSCs)被认为是胶质瘤细胞中的一个重要亚群,GSCs是具有增殖和分化潜能的一群细胞,... 详细信息

一、背景和目的脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的肿瘤,胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,五年生存率大约于9.8%。近年来,胶质瘤干细胞(GSCs)被认为是胶质瘤细胞中的一个重要亚群,GSCs是具有增殖和分化潜能的一群细胞,具有自我更新复制的能力和多向分化的能力。许多研究表明,GSCs在胶质瘤中仅占不到1%的比例,而却被认为与胶质瘤的高度异质性、胶质瘤的复发密切相关。在胶质瘤干细胞分子标志物的研究中,CD133被普遍认为是胶质瘤干细胞的“干性”标志物,越来越多的研究开始针对CD133+的胶质瘤干细胞探讨靶向药物对胶质瘤的治疗效果。但研究的不够深入,在GSCs中存在一群CD133-的“干样”肿瘤细胞,同样在肿瘤的发展侵袭中起着重要作用。其中a2b5+的“干样”肿瘤细胞同样有CD133+干细胞相近的生物学特性。a2b5是少枝-II型星形胶质细胞祖细胞的标志物,少枝-II型星形胶质细胞祖细胞可分化为少枝胶质细胞或II型星形胶质细胞。近年来的部分研究表明a2b5也是一种干细胞的标志物,a2b5+的这一群细胞甚至可以认为是胶质瘤细胞的部分起源。从胶质瘤中分选出a2b5+的胶质瘤干样细胞球也表达nestin等干性标志物,并可以分化出神经元细胞,星形胶质细胞和少突胶质细胞。在本研究中,我们通过改进细胞建株技术,通过分选纯化-单克隆法从实体肿瘤中获取a2b5+/CD133-的这一群胶质瘤“干样”细胞亚群,并希望通过这一方法可以稳定、高效、大量的从肿瘤组织中获取a2b5+/CD133-的胶质瘤干样细胞。适应针对a2b5+/CD133-的胶质瘤的靶向药物研究的需要,为胶质瘤干细胞的研究提供实验工具。二、材料和方法1、临床组织样本2、免疫组化检测胶质瘤相关蛋白在临床组织样本中的表达。3、原代培养、分选纯化-单克隆法建立a2b5+/CD133-干样细胞株SHG-ZWs、细胞免疫荧光检测a2b5蛋白表达率。4、MTT实验、流式细胞检测细胞增殖、细胞周期。5、二次成球实验、免疫荧光实验、多向分化实验检测SHG-ZWs细胞干性。6、裸小鼠原位移植瘤模型检测SHG-ZWs细胞成瘤性。三、结果1、脑胶质瘤患者的临床影像学和病理资料本例脑肿瘤患者头颅CT诊断为左颞顶叶复发胶质瘤,术后病理为胶质母细胞瘤。组织学检查表现出明显的核异型性,肿瘤细胞的直径变化大,核分裂和核不规则多见,胞浆丰富呈现为“裸核样细胞”。高度增殖的肿瘤细胞小而圆,伴有单核或多核瘤巨细胞。免疫组化显示:GFAP(+)、S-100(+)、vimentin(+)、Ki-67(65%),a2b5(-)、EGFR(+)、MGMT(+)、p53(+)、Nestin(+)。2、人源胶质瘤细胞SHG-140的原代培养及SHG-ZW细胞株的克隆肿瘤组织块经原代培养获得SHG-140细胞系,在10代后生长迅速,传至20代后使用免疫磁珠分选出a2b5+的细胞亚群,在通过有限稀释法对这一亚群的细胞进行单细胞克隆,稳定传代得到了至20代的a2b5+的细胞株命名为SHG-ZW。SHG-ZW细胞呈贴壁生长,胞核大胞质少,核内不均匀性,核分裂像多见,染色质增加。免疫荧光染色显示第20代SHG-140细胞系与第20代SHG-ZW细胞株的相关分子表型特征,免疫荧光染色显示:在SHG-140细胞系中含有多种亚群的细胞,分子病理特征相对混杂,表现出较高的增殖指数GFAP(+)vimentin(+)S-100(+)VEGF(+)Ki-67(52%);而从SHG-ZW细胞株的细胞免疫荧光结果可见,SHG-ZW细胞株是由单个亲代细胞克隆而获得的子代细胞群,在20代表现出GFAP(-)a2b5(+)vimentin(+)s-100(+)VEGF(+)Ki67(48%)。3、人脑胶质瘤细胞SHG-ZW的增殖速度和细胞周期第20代SHG-ZW细胞消化重悬后,以血球计数仪计数2x107个种植于10mm培养皿中,SHG-ZW细胞在48小时内增殖迅速,在96小时后增长逐渐变缓慢,在120小时后达到生长平台期。取第20代生长第2天的SHG-ZW细胞经流式细胞检测分析细胞周期,G1期、S期和G2期细胞比例分别为75.08%,8.40%,16.11%。4、SHG-ZW细胞转化成SHG-ZWs细胞及其细胞周期分析第20代SHG-ZW细胞在NSCM中培养2周后见干细胞样球体,悬浮生长。传至第6代,可见大量SHG-ZWs细胞悬浮生长。SHG-ZWs细胞的G1期、S期和G2期细胞比例分别为42.65%,12.65%和45.47%。SHG-ZWs细胞二次球体形成率为97.6%,培养21d后球体平均直径达到220μm。***-ZWs细胞的分子表型特点取第10代SHG-ZWs细胞进行免疫荧光细胞化学检测,其中SOX2(+),nestin(+),nanog(

关键词：胶质瘤胶质瘤干细胞 a2b5 CD133

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MiR-218-5p抑制a2b5+/CD133-胶质瘤干细胞“干性”及侵袭的实验研究

MiR-218-5p抑制A2B5+/CD133-胶质瘤干细胞“干性”及侵袭的实验研...

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作者：吴至武苏州大学

学位级别：硕士

背景及目的胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,具有很强的侵袭性、增殖速度快和高复发率。胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSCs）的存在是胶质瘤发生和复发的根源,治疗胶质瘤的关键是要彻底切除肿瘤的同时全面消除胶质瘤干... 详细信息

背景及目的胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,具有很强的侵袭性、增殖速度快和高复发率。胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSCs）的存在是胶质瘤发生和复发的根源,治疗胶质瘤的关键是要彻底切除肿瘤的同时全面消除胶质瘤干细胞。根据胶质瘤干细胞表面标志物表达的不同,可将GSCs分成不同的亚群,目前针对不同亚群GSCs的生物学特性研究相对较少。在过去的几十年中,越来越多的研究已经证实,微小RNA（mi RNAs）,一类非编码RNA,在人脑胶质瘤中发挥至关重要的作用。Micro RNA通过对靶向m RNA的降解和翻译水平的调控,从而在肿瘤的发生发展中起着癌基因和抑癌基因的作用。mi RNA可参与调控胶质瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管形成和耐放化疗性,对GSCs的自我更新和分化同样具有调控作用。本实验室近年培养出了一株表达a2b5+/CD133-的胶质瘤干细胞株,将其命名为SHG-139s。通过基因芯片技术筛选发现,mi R-218-5p在SHG-139s中表达显著降低,查阅相关文献研究已证实,mi R-218-5p的成熟体mi R-218在胶质瘤中呈低表达,上调mi R-218的表达后能显著促进CD133+胶质瘤干细胞的分化,抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭性。针对mi R-218-5p在a2b5+/CD133-人脑胶质瘤干细胞中的作用目前国内外仍未见相关报道。因此推测,mi R-218-5p对a2b5+/CD133-人脑胶质瘤干细胞（SHG-139s）的干细胞特性维持及侵袭能力可能起着重要的调控作用。研究方法收集2008年5月-2013年1月苏州大学附属第一医院神经外科手术切除的经病理证实的人脑胶质瘤组织标本53例,脑外伤减压术切除的非瘤脑组织6例,培养5例胶质瘤细胞株,3例胶质瘤干细胞株,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测人非瘤脑组织、人脑胶质瘤组织、人脑胶质瘤细胞株和人脑胶质瘤干细胞株中mi R-218-5p的表达;构建mi R-218-5p过表达及RNA干扰（RNAi）的慢病毒载体,稳定转染a2b5+/CD133-胶质瘤干细胞株;将转染成功后的SHG-139s行二次球体形成实验观察转染后的干细胞成球率,免疫荧光及q RT-PCR检测干细胞标志物a2b5、CD133、Nestin、PLAGL2、ALDH1、SOX2的表达变化,探讨mi R-218-5p对SHG-139s人脑胶质瘤干细胞干性维持的影响。transwell实验及检测基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化,探讨mi R-218-5p对SHG-139s人脑胶质瘤干细胞侵袭性的影响;结果q RT-PCR结果显示:mi R-218-5p在人脑胶质瘤组织中的表达显著低于非瘤脑组织;高级别胶质瘤组织中表达显著低于低级别胶质瘤组织;在人胶质瘤细胞株中的表达要显著低于正常人脑星形细胞株（NHA）;mi R-218-5p在SHG-139s（a2b5+/CD133-）中的表达要低于SU2（CD133+）和U87s（CD133+）。干细胞标志物免疫荧光及q RT-PCR结果显示上调mi R-218-5p能降低SHG-139s干细胞标志物a2b5、SOX2、Nestin、ALDH1和PLAGL2的表达,免疫荧光结果显示mi R-218-5p表达的变化对CD133的表达没有明显影响,CD133在各对照组中均无表达。Transwell实验及基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化显示mi R-218-5p能显著抑制SHG-139s胶质瘤干细胞的侵袭性。结论（1）mi R-218-5p在人脑胶质瘤组织和细胞中低表达;（2）mi R-218-5p在SHG-139s胶质瘤干细胞中显著低表达;（3）mi R-218-5p可能作为抑癌基因在胶质瘤中发挥作用,高表达的mi R-218-5p可抑制SHG-139s的干性维持及抑制其侵袭能力。

关键词： microRNA a2b5 CD133 胶质瘤干细胞侵袭

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Astrocyte transformation into intermediate precursor cells induced by ACM of scratch-insulted astrocytes:implication for its heterogeneity of de-differentiation in vitro

Astrocyte transformation into intermediate precursor cells i...

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第八届全国学术会议

作者： Hao YANG~1,Rui CONG~2,Xi-Ying JIAO~1,Si-Wei YOU~(1,*),Gong JU~(1,*) 1 Laboratory of Cellular & Molecular Lab,PLA Insitute of neurosciences,The fourth Military Medical,Xi’an 710032, China 2 Department of Institute of Orthopaedics,Xi Jing Hospital,The fourth Military Medical,Xi’an 710032,China

Objective Our previous study demonstrated definitely that the mature astrocytes could undergo a de- differentiation of process and further transform into multipotential of neural stem cells(NSCs),arising from diffusible factors released in medium of scratch-insulted astrocytes(ACM).However,these neurospheres passaged from one neurosphere derived from de-differentiated astrocytes possess a completely distinct differentiation characteristic when induced by same treatment *** heterogeneity in cell differentiation is still far from *** present study is to explore whether astrocytes could de-differentiate into intermediate precursor cells,and to further understand the mechanism of the heterogeneity in cell *** Primarily cultured astrocytes were treated for different time(1, 5 and 10 days,respectively) with *** and GFAP double-labeled indirect immunofluorescence was carried out to characterize these cells,and the change of Ab and GFAP reactivity was analyzed by cell ***,western-blot analysis was used to determine the changes of Ab protein expression following ACM induction at different time points. Finally,the rate of proliferation was determined by immunocytochemical detection of brdU incorporating cells in combination of NG2 ***(1) Purified astrocytes could de-differentiate into intermediate precursor cells(IPCs) with addition of ACM to the culture,which can express the markers of IPCs including Ab and NG.(2) Apart from the number of a2b5 and NG cells,the percentage of proliferative cells as labeled with brdU,progressively increased with prolonged culture time ranging from 1 to 10 days when compared to control groups;(3) The protein level of Ab in cells also increased *** These results reveal that astrocytes do not de-differentiate fully into NSCs directly when induced by ACM,rather they generate intermediate or more restricted precursor cells that may undergo progressive de-di

关键词： astrocytes de-differentiation intermediate precursor cell a2b5 NG2 neural stem cell cell culture

来源： cnki会议评论

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