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抗非洲猪瘟病毒p54、A238 l蛋白单克隆抗体的研制及阻断ElISA方法的建立

抗非洲猪瘟病毒p54、A238 L蛋白单克隆抗体的研制及阻断ELISA方法...

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作者：郑南南河南农业大学

学位级别：硕士

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、出血性传染病,传染源为带毒的家猪、野猪、疣猪、软蜱等,主要通过呼吸道和消化道等途径传播。非洲猪瘟发病过程短,个别较长。ASFV感染家猪后会侵害猪... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、出血性传染病,传染源为带毒的家猪、野猪、疣猪、软蜱等,主要通过呼吸道和消化道等途径传播。非洲猪瘟发病过程短,个别较长。ASFV感染家猪后会侵害猪的各个系统,呼吸系统;肺、咽、喉。泌尿系统;肾脏、膀胱。内分泌系统;睾丸、卵巢。消化系统;胃、小肠、大肠等。家猪感染后致死率达100%,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。非洲猪瘟首次在1920年通过撒哈拉传播到欧洲,2018年8月3日,首次在我国辽宁省沈阳市出现非洲猪瘟疫情。截止2020年,非洲猪瘟疫情已经覆盖全国31个省、自治区、直辖市和香港特别行政区。由于ASFV的结构复杂,抵抗力强,传播速度快,至今还没有研制出特效的生物制品用于疫情防控,现阶段防控措施主要依赖于隔离、扑杀、消毒、限制流通等生物防控手段来阻止疫情的蔓延。因此,迫切需要完全拥有自主知识产权的国产化诊断试剂助力我国非洲猪瘟疫情防控。ASFV p54蛋白由E183l基因编码的结构蛋白,它能作为病毒粒子的运输工具,p54蛋白在ASFV形态发生和病毒感染过程中起着重要作用,有报道显示在家猪感染7～10 d就可以检测到p54蛋白的特异性抗体。而ASFV A238L蛋白是由A238L编码的非结构蛋白,该蛋白结合乙酰转移酶P300/CBP的氨基末端区域,A238L通过促进TBK1和IFR3的磷酸化,诱导IFN-P以及ISG的产生,抑制病毒复制。和绝大多数病毒的非结构基因的功能相反,A238L能抑制NF-κB的活性,但却具有促进感染免疫的功能。1、非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备与表位的鉴定使用p54的引物扩增E183l基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建pET-30a(+)-p54重组质粒,将成功构建的pET-30a(+)-p54质粒转化至感受态Bl21(DE3)中,使用终浓度为0.1 mmol/l的IPTG,诱导表达p54蛋白。使用亲和层析法纯化p54蛋白,用纯化蛋白免疫雌性BAlB/C小鼠,免疫4次,使用单克隆抗体制备技术,获得抗p54的单克隆抗体。建立非洲猪瘟病毒p54蛋白阻断ElISA检测的方法,最佳蛋白包被浓度为4μg/m l。将获得抗p54的单克隆抗体用Western blot和IFA检测,发现具有良好的特异性。以所制备的非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体6E8G8E1为对象,应用Dot-blot和ElISA方法确定单克隆抗体p54-6E8G8E1所识别的最短抗原表位。结果表明,单克隆抗体p54-6E8G8E1的抗原表位定位于110-TMSAIENlR-118。该研究获得的非洲猪瘟病毒p54蛋白和针对p54蛋白产生的单克隆抗体,为后续检测方法的建立提供实验材料。2、非洲猪瘟病毒A238 l蛋白的原核表达与单克隆抗体的制备非洲猪瘟病毒A238 l基因克隆至pET-28a(+)载体中,构建了pET-28a(+)-A238 l原核表达载体,将成功构建的pET-28a(+)-A238 l转化至感受态Bl21(DE3)中,使用终浓度为0.1 mmol/l的IPTG,诱导表达A238 l蛋白。纯化A238 l蛋白,用纯化后的A238L蛋白免疫雌性BAlB/C小鼠,免疫4次,获得抗A238 l的单克隆抗体。使用间接ElISA检测方法进行检测,筛选得到阳性克隆细胞,进行3次亚克隆后,获得5株特异性强、灵敏性高的抗A238 l的单克隆杂交瘤细胞株,制备腹水,使用间接ElISA检测方法测定腹水效价为1:500000,Western blot结果显示获得的单克隆抗体与原核表达的A238L蛋白发生特异性反应,IFA测定的A238 l蛋白的单克隆抗体,也具有良好的特异性。该研究获得5株特异性强、灵敏性高的单克隆抗体,为后续检测方法的建立提供材料。3、非洲猪瘟病毒p54蛋白阻断ElISA检测方法的建立及初步应用通过ElISA检测所获得的5株单克隆抗体效价,对比5株单克隆显色时间,最终挑选1株效果最佳单克隆抗体6E8G8E1,将所获单克隆抗体6E8G8E1进行酶标记,获得的6E8G8E1-HRP酶标抗体,作为后续研究对象。对6E8G8E1单克隆抗体进行一系列特性验证,6E8G8E1的亚型鉴定重链IgG1和轻链Kappa,其效价为1:500000。利用p54蛋白和单抗6E8G8E1-HRP建立了检测ASFV抗体的阻断ElISA方法。根据传统程序建立方法并进行条件优化,最终得到;p54的稀释倍数为4μg/m l,单抗6E8G8E1的稀释倍数为1:1000,待检血清的最佳稀释倍数为1:16,血清和抗体的反应时间均为1 h,温度37℃。非洲猪瘟抗体阳性的判定标准是待检样品的阻断率≥62%,反之则判定为ASFV抗体阴性。

关键词： p54 A238L 蛋白表达单克隆抗体阻断ElISA 抗原表位

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非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L激活感染免疫TBK1-IRF3信号通路

非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L激活感染免疫TBK1-IRF3信号通路

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作者：杨兰兰扬州大学

学位级别：硕士

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种带囊膜的双股DNA病毒。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)典型症状为高热、出血、厌食、腹泻、便秘和皮肤发绀等。最新报道表明,ASFV已发展为临床症状不明显的自然变异株,其致死率... 详细信息

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种带囊膜的双股DNA病毒。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)典型症状为高热、出血、厌食、腹泻、便秘和皮肤发绀等。最新报道表明,ASFV已发展为临床症状不明显的自然变异株,其致死率高,流行速度快,防控困难。ASFV基因组庞大,免疫逃避机制复杂,研究ASFV编码蛋白参与感染免疫的相关分子机制,将为疫苗开发奠定一定的理论基础,进而为生猪养殖业的发展提供安全有效的保护措施。宿主细胞的天然免疫系统在抵御病原微生物的入侵过程中发挥重要作用。cGAS识别胞质DNA,激活cGAS后结合至内质网上的STING。RIG-I则识别胞质中的RNA,RIG-I激活后结合至线粒体上的MAVS。cGAS-STING和RIG-I-MAVS信号通路激活后均促进TBK1和其下游的IRF3磷酸化,IRF3入核后诱导Ⅰ型干扰素(Interferon,IFN)的转录。DNA病毒模拟物poly(dA:dT)和RNA病毒模拟物poly(I:C)均可激活IRF3,诱导IFN表达。ASFV作为一个最大的DNA病毒编码许多非结构基因。DP148R、DP96R和K205R等非结构蛋白参与调控宿主细胞的抗病毒免疫反应。A238L是ASFV的一个非结构蛋白,该蛋白结合乙酰转移酶p300/CBP的氨基末端区域,抑制NF-κB介导的先天免疫反应。然而,A238L是否调控IRF3介导感染免疫尚未有研究报道。我们从GenBank数据库获得ASFV全基因组序列,设计A238L引物,以ASFV感染猪的脾脏组织中提取的DNA为模板,PCR扩增A238L全基因片段并克隆至pcDNA3.1-3×Flag真核细胞的表达载体。转染质粒DNA至三种不同的细胞系(l929,小鼠成纤维细胞;IPEC-DQ,猪肠上皮细胞;3D4/21,猪巨噬细胞)。结果显示,A238L在不同细胞均按照预测的蛋白分子量表达,证明真核表达质粒构建成功。我们首先研究了 A238L是否影响IRF3的激活。我们选用了上述三种细胞转染A238L质粒,免疫印迹试验(Westernblot,WB)分析TBK1和IRF3的磷酸化。WB结果显示,转染了 A238L基因的细胞中TBK1和IRF3磷酸化水平显著高于转染了空载体的对照细胞。转染了 A238L基因的细胞经poly(dA:dT)、poly(I:C),Ⅰ型单纯疱疹病毒(human simplex virus 1,HSV-1)和仙台病毒(Sendai virus,SeV)处理后,TBK1 和IRF3的磷酸化水平进一步增加。和前人的报道结果一致,A238L转染l929细胞后则抑制NF-κB信号通路中的关键蛋白IKK和p65亚单位的磷酸化水平,荧光素酶报告基因分析结果显示,A238L能够抑制NF-κB驱动的荧光素酶报告基因的表达。间接免疫荧光染色发现,A238L转染l929细胞后,细胞核中IRF3阳性细胞的数量显著增加。WB结果显示,转染A238L的细胞裂解液的胞核成份中的pIRF3 水平亦显著高于转染空载体的对照细胞中的pIRF3水平。荧光素酶报告基因分析结果显示,A238L能够激活IRF3驱动的荧光素酶报告基因的表达;A238L激活poly(dA:dT)、poly(I:C)、HSV-1和SeV诱导的IRF3的转录活性。同时,A238L也可激活IFN-β启动子活性;poly(dA:dT)和poly(I:C)能够显著增强A238L对IFN-β启动子的激活。荧光定量RT-PCR发现转染了 A238L质粒的l929细胞中IFN-β、干扰素刺激基因(ISG)和Mx1表达水平显著高于转染空载体的细胞中的表达水平,A238L亦进一步促进poly(dA:dT)或poly(I:C)诱导的IFN-β和ISG的表达水平。我们进一步研究了转染A238L质粒的l929细胞培养上清中的抗病毒活性。我们用A238L和poly(dA:dT)单独或共同转染l929细胞,取其上清,加入至仙台病毒(携带绿色荧光蛋白,GFP)感染的细胞,用流式细胞术分析病毒感染情况。结果显示,A238L转染细胞后其培养上清抑制仙台病毒复制的能力显著高于转染空载体转染的对照培养上清;poly(dA:dT)与A238L共处理能够进一步抑制仙台病毒复制。最后我们检测了 A238L对TBK1乙酰化蛋白水平的影响。结果显示,A238L通过下调TBK1乙酰化来增强TBK1-IRF3通路的激活并促进抗病毒免疫反应。综上所述,A238L通过促进TBK1和IRF3的磷酸化,诱导IFN-β以及ISG的产生,抑制病毒复制。和绝大多数病毒的非结构基因的功能相反,A238L能抑制NF-κB的活性,但却具有促进感染免疫的功能。

关键词：非洲猪瘟病毒 A238L 宿主免疫调控 TBK1-IRF3

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