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合成PHA基因组克隆片段的序列分析及相关基因的分离

合成PHA基因组克隆片段的序列分析及相关基因的分离

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作者：方志友安徽农业大学

学位级别：硕士

聚-β-羟基烷酸是微生物代谢过程中产生的贮存物质，是制造塑料的新型原料，可被微生物完全降解，利用植物生物反应器合成PHA是现在研究热点。本论文主要研究实验室拥有的从Pseudomanas菌中克隆的合成PHA的基因组片段，利用生物信息学... 详细信息

聚-β-羟基烷酸是微生物代谢过程中产生的贮存物质，是制造塑料的新型原料，可被微生物完全降解，利用植物生物反应器合成PHA是现在研究热点。本论文主要研究实验室拥有的从Pseudomanas菌中克隆的合成PHA的基因组片段，利用生物信息学方法分析其序列特征，从中找出与PHA合成相关的基因，并用PCR方法分离这些基因。结果显示： 1 使用核酸分析软件对合成PHA克隆片段的序列进行分析，找到了五个开放阅读框，其中ORF1、ORF2和ORF3在同源性搜索中与合成PHA相关基因的同源性很高，而ORF4、ORF5与PHA合成的基因几乎没有同源性。 2 对与ORF1、ORF2和ORF3高度同源性的蛋白序列进行序列比对分析，表明它们与合成PHA的相关基因编码的蛋白序列之间存在高度的保守性，它们的功能可能分别对应于PHA合酶(PhaC)、3-酮硫裂解酶(PhaA)和乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)。其中PHA合酶与其它Pseudomonas菌中的PHA合酶在蛋白质序列上存在较大的差异，可能是一种新的PHA合酶。 3 通过对序列的启动子序列区搜索，发现PhaC、PhaA与PhaB是由同一个启动子控制转录的，即它们处在同一个操纵元作用之下;而ORF4和ORF5由另一个启动子调控。 4 综合分析，推测PHA合成的分子机制：首先由β-酮硫裂解酶(PhaB)催化乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA，乙酰乙酰CoA在依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶(PhaA)的作用下被还原成D(-)—3—羟丁酰CoA，随后由PHA合酶(PhaC)催化单体的D(-)—3—羟丁酰CoA聚合形成PHA。 5 利用PCR技术分离出phaC、phaA和phaB基因，并成功地克隆到pGEM-T载体上。 6 通过HindⅢ／sacI酶切、连接、转化，成功地把种子特异性表达的7s启动子连接到切除CaMV35s启动子的pBI121中，构建成植物种子特异性的表达载体。

关键词：聚-β-羟基烷酸生物信息学同源性分析多序列比对分析聚合酶链式反应 7s启动子植物表达载体

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PHA基因植物表达载体的构建与转化研究

PHA基因植物表达载体的构建与转化研究

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作者：连超群安徽农业大学

学位级别：硕士

为了解决化工合成塑料对环境造成污染这一难题，开发和利用生物可降解塑料日益受到人们的重视。聚羟基烷酸（polyhydrocylkanotes PHAs）作为一种大的聚合物，既是许多种细菌的碳源贮存形式，又是一种生物可降解塑料的原料，利用植物生... 详细信息

为了解决化工合成塑料对环境造成污染这一难题，开发和利用生物可降解塑料日益受到人们的重视。聚羟基烷酸（polyhydrocylkanotes PHAs）作为一种大的聚合物，既是许多种细菌的碳源贮存形式，又是一种生物可降解塑料的原料，利用植物生物反应器生产PHA是当前生产生物可降解塑料研究的热点。本课题组从合成PHA的pseudomanas　sp.菌株的亚克隆基因组片段中，分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段，定向克隆至原核表达载体pBV220，通过对其生物活性与功能分析，确证了基因phaA、phaB和phaC的生物学功能;为了通过植物生物反应器对这三个基因进一步研究利用，本实验利用这三个基因构建了两组可用于不同植物生产PHA的真核表达载体,并对紫叶酢浆草进行PHA基因遗传转化的初步研究，获得主要结果如下：利用克隆的phaA、phaB、phaC三个基因分别构建了可用于转化紫叶酢浆草表达载体pBI121-A、pBI121-B、uBquiting-C;可用于玉米转化的种子特异性表达载体p7s-A、pBI121-s-B、uBquiting-C。经酶切分析、PCR扩增进一步验证所构建的表达载体是正确的。通过对紫叶酢浆草组织培养的研究，初步建立了紫叶酢浆草的再生体系。筛选出诱导愈伤的最佳培养基为Ms+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.1 mg/L;分化的最佳培养基为Ms+NAA 0.9 mg/L +6-BA 0.4 mg/L;生根培养基为Ms+2,4-D 0.5 mg/L;愈伤组织Kan抗性筛选的最佳浓度为58 mg/L。利用基因枪对紫叶酢浆草愈伤组织进行了PHA基因表达载体的遗传转化，通过Kan抗性筛选获得了96株抗性小苗，经PCR检测，其阳性植株率为1.57%。在7株中phaA、phaB单价转化的分别为一株;含有phaA和phaB基因共转化一株;含有phaA和phaC基因共转化一株;含有phaB和phaC基因共转化两株;含有phaA和 phaB和phaC三个基因共转化一株。其转基因株进一步确证快繁扩增、遗传稳定性和PHA表达效果的分析正在进一步研究之中。

关键词： PHA(聚-β-羟基烷酸) 7s启动子植物表达载体共转化再生体系

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