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甘蔗PsbR亚基应答SCMV侵染及其与SCMV-6k2的互作

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作物学报 2021年第8期47卷 1522-1530页

作者：张海程光远杨宗桃刘淑娴商贺阳黄国强徐景升福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心/农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室福建福州350002

光系统II(Photosystem II,PSII)的PsbR亚基对于放氧复合体(oxygen-evolving complex)的组装和稳定具有至关重要的作用。本课题组前期克隆了甘蔗(Saccharum ***)的PsbR亚基编码基因,命名为ScPsbR,并利用酵母双杂交技术(yeast two hybrid,Y2H)验证了ScPsbR与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6k2的互作。本研究通过生物信息学分析表明,ScPsbR具有典型的PsbR亚基结构域,无信号肽,具有1个跨膜结构域,为稳定的疏水性蛋白。系统进化树分析表明,该蛋白在C3和C4植物中存在明显的分化。亚细胞定位试验表明,ScPsbR定位于叶绿体且与SCMV-6k2共定位。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步验证了ScPsbR与SCMV-6k2的互作。实时荧光定量PCR检测表明,ScPsbR基因表达具有显著的组织特异性,在根和茎中表达极少,未成熟叶片和初衰叶中次之,成熟叶片中相对表达量最高;SCMV侵染显著影响ScPsbR基因表达,ScPsbR基因在侵染0~12 h显著上调,侵染1~5 d下调至略低于对照的水平,但差异不显著,侵染7~15 d显著下调。

关键词： PsbR亚基甘蔗花叶病毒 6k2 蛋白互作

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甘蔗类泛素蛋白UBL5应答SCMV侵染及其与SCMV-6k2的互作

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作物学报 2022年第2期48卷 332-341页

作者：杨宗桃刘淑娴程光远张海周营栓商贺阳黄国强徐景升福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心/农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室福建福州350002

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术... 详细信息

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(***)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6k2互作的类泛素蛋白UBL5,命名为Sc UBL5,长度为73aa。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步证实了Sc UBL5与SCMV-6k2互作;生物信息学分析表明,Sc UBL5为稳定的亲水性非分泌蛋白,无信号肽和跨膜结构。系统进化树分析表明,Sc UBL5具有明显的种属特异性。亚细胞定位分析表明,Sc UBL5定位于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,Sc UBL5基因的表达具有明显的组织特异性,在完成形态建成的正一叶、第7叶、根和第8节间中的相对表达量显著高于未成熟的心叶和第3节间;SCMV侵染对Sc UBL5基因表达影响显著,Sc UBL5基因在侵染早期显著上调,侵染后期下调但显著高于对照。

关键词：甘蔗类泛素蛋白甘蔗花叶病毒 6k2

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甘蔗PsbS亚基应答甘蔗花叶病毒侵染及其与6k2蛋白的互作研究

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作物学报 2020年第11期46卷 1722-1733页

作者：张海刘淑娴杨宗桃王彤程光远商贺阳徐景升福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心/农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室福建福州350002

非光化学猝灭(non-photochemical quenching,NPQ)是高等植物主要的光保护调节机制,光合系统Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)的Psb S亚基在NPQ起关键作用。甘蔗(Saccharum ***)中PSⅡPsb S亚基应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的侵染尚未见报道。本课题组在前期研究中克隆了甘蔗的Psb S亚基编码基因,命名为Sc Psb S,该基因开放读码框(open reading frame, ORF)长度为798 bp,编码长度为265个氨基酸的蛋白。生物信息学分析表明, Sc Psb S为稳定的疏水性蛋白,具有叶绿体定位信号,有4个跨膜结构域;具有典型的Psb S亚基结构域。系统进化树分析表明, Sc Psb S在单子叶、双子叶以及单子叶的C3和C4植物中存在明显的分化。亚细胞定位分析表明,Sc Psb S定位于叶绿体且与SCMV-6k2部分共定位于叶绿体。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验进一步证实了ScPsbS与SCMV-6k2互作。实时荧光定量PCR分析发现, ScPsbS基因的表达具有明显的组织特异性,在成熟叶片中相对表达量最高,未成熟叶片和初衰叶中次之,茎和根中几乎不表达;SCMV侵染对ScPsbS基因表达影响显著, ScPsbS基因在侵染早期显著上调,侵染后期没有明显的差异。

关键词：甘蔗 PsbS亚基甘蔗花叶病毒 6k2 光保护

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大豆花叶病毒组分蛋白P1、P3、CI、6k2、HC-Pro大豆互作因子的筛选及功能研究

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大豆花叶病毒组分蛋白P1、P3、CI、6K2、HC-Pro大豆互作因子的筛...

作者：牛妞内蒙古大学

学位级别：硕士

大豆(Glycine max L.)是重要的粮食和经济油料,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)的侵袭会造成大豆产量和品质的严重损失。一般情况下,病毒组分蛋白和寄主蛋白协同作用实现病毒侵染。同时有些宿主蛋白可以通过识别病毒蛋白来完成... 详细信息

大豆(Glycine max L.)是重要的粮食和经济油料,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)的侵袭会造成大豆产量和品质的严重损失。一般情况下,病毒组分蛋白和寄主蛋白协同作用实现病毒侵染。同时有些宿主蛋白可以通过识别病毒蛋白来完成宿主免疫,因此对于病毒成分蛋白与宿主互作蛋白的研究具有重要意义。SMV基因组编码11个蛋白,其中P1、P3、CI、HC-Pro及6k2参与了病毒的运动、复制及传播。本论文利用酵母双杂交技术,构建了上述SMV五个组分蛋白的诱饵载体,筛选了大豆c DNA文库中的互作蛋白,分别得到了10个P1候选互作蛋白、17个P3候选互作蛋白、25个CI候选互作蛋白、31个6k2候选互作蛋白以及8个HC-Pro候选互作蛋白。通过多组学联合分析及结构域的功能预测,结合文献报道挑选出了其中5个宿主蛋白:GmGIP2(Probable aspartic proteinase GIP2)、GmSTOP1(Sensitive to proton rhizotoxicity1)、GmRPS6(Ribosomal prote in S6)、GmNTM1(NAC with transmembrane motif1)及GmSRC2(Soybean g ene regulated by cold2),并对其进行了互作与功能研究。主要研究结果如下:(1)克隆P1、P3、CI、HC-Pro及6k2的编码基因,分别构建重组p GBkT7诱饵载体在大豆c DNA文库中进行互作蛋白筛选,对QDO平板上生长的阳性克隆测序并进行大豆基因组的blast比对。通过开放数据库的转录组数据挖掘、GO、k EGG、结构域预测及蛋白互作网络构建等方法对筛选到的互作蛋白进行了生物信息学分析。GO分析结果表明大多互作蛋白主要存在于细胞膜、细胞核及叶绿体,具有金属离子结合、催化活性、DNA结合等分子功能。并参与了运输、代谢、光合作用、DNA转录模板调控等生物学过程。kEGG分析表明多数候选互作蛋白参与了光合作用、碳代谢、抗原传递和加工等信号通路。在转录组数据中分析了SMV接种大豆后目的基因的动态表达水平。通过构建蛋白互作网络证实了候选蛋白不仅与SMV组分蛋白互作,候选蛋白之间同样存在互作关系。将所有候选互作蛋白构建互作网络交叉分析后发现了一个蛋白CSN5(COP9 signalosome complex submit5),其与病毒蛋白P1、P3、CI及HC-Pro均存在互作关系,且与GmSTOP1、GmHAT22(Homeobox-leucine zipper protein HAT22)和GmRPS6均存在可能的互作关系。(2)病毒的传播与复制在病毒侵染过程中至关重要。蚜虫传播是SMV感染寄主的主要方式,而HC-Pro在介导蚜传中发挥重要作用。6k2介导病毒和寄主细胞膜的结合,参与病毒复制。因此,从所有互作蛋白中我们重点分析了6k2和HC-Pro的互作蛋白。其中,GmGIP2、GmNTM1、GmRPS6、GmSRC2及GmSTOP1的同源基因曾被报道与植物免疫反应有关。因此对其进行了进一步的互作验证与功能研究。酵母双杂交结果表明GmGIP2与HC-Pro互作,GmNTM1、GmRPS6、G m SRC2及GmSTOP1与6k2互作。在抗性功能上,通过5个基因在本氏烟草瞬时表达体系中与大豆花叶病毒侵染性克隆SMV-GFP的共表达,证实了GmGIP2与G m STOP1对SMV存在抗性,而GmNTM1、GmRPS6和GmSRC2对SMV不存在直接的抗性。(3)上述实验中证实了GmSTOP1和GmGIP2对SMV具有部分抑制作用。因此对GmGIP2和GmSTOP1的抗性机制进行了进一步研究。HC-Pro和6k2识别其相应互作蛋白GmGIP2与GmSTOP1,导致GmGIP2与GmSTOP1的抗病毒活性减弱。GmGIP2、GmSTOP1与SMV-GFP在底叶的表达与分段侵染均证明其能够抑制SMV的扩散。通过亚细胞定位对两个基因发挥功能的位置进行了检测,结果显示,GmGIP2定位于细胞膜,GmSTOP1定位于细胞核。双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation)的结果显示GmGIP2与HC-Pro的互作位置在细胞膜上,GmSTOP1与6k2的互作位置在细胞核内,这与它们的亚细胞定位相一致。综上所述,我们推测大豆GmGIP2和GmSTOP1分别通过识别SMV的HC-Pro和6k2来介导对该病毒的抗性。

关键词：大豆花叶病毒宿主互作蛋白 6k2 HC-Pro GmSTOP1 GmGIP2 抗性

甘蔗易化子家族蛋白Sc ZIFL1与6k2互作应答SCMV侵染

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作物学报 2022年第12期48卷 3080-3090,I0001-I0012页

作者：刘淑娴杨宗桃程光远张海周营栓商贺阳黄国强徐景升农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心/教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室福建福州350002

易化子超家族转运蛋白(major facilitator superfamily,MFS)在生物中普遍存在,锌诱导类辅助因子(zinc induced facilitator like,ZIFL)是MFS成员,参与小分子有机物运输。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharum ***)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6k2互作的ZIFL,命名为Sc ZIFL1。本研究利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)进一步验证了Sc ZIFL1与SCMV-6k2的互作。生物信息学分析表明,Sc ZIFL1长度为484个氨基酸,无信号肽,具有12个跨膜结构域,为不稳定的疏水性蛋白。序列比对分析表明,Sc ZIFL1具有MFS保守的半胱氨酸模体、特征基序及反向运输基序。系统进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物之间,以及单子叶C_(3)植物和C_(4)植物之间存在明显分化。亚细胞定位试验表明,Sc ZIFL1定位于液泡膜,部分与SCMV-6k2共定位。实时荧光定量PCR分析发现,Sc ZIFL1基因的表达具有明显的组织特异性,在茎中表达最高,叶中次之,根中最低;在完成形态建成且处于旺盛工作状态的+1叶和第8节间中的相对表达量显著高于未成熟的心叶、第3节间和渐衰叶片+7叶;接种SCMV后,Sc ZIFL1表达量在侵染早期显著上调,随后持续高表达。

关键词：甘蔗花叶病毒 6k2 ZIFL1 蛋白互作

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甘蔗ScCRT1基因克隆及其应答SCMV侵染分子机制的研究

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作物学报 2021年第1期47卷 94-103页

作者：张海程光远杨宗桃王彤刘淑娴商贺阳赵贺徐景升福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心/农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室福建福州350002

钙网蛋白(calreticulin,CRT)在真核生物中广泛表达,是重要的分子伴侣和钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+稳态、钙依赖信号、内质网质量控制、植物生长发育、免疫反应和逆境应答等多种生物学过程。甘蔗(Saccharum ***)中CRT应答甘蔗花叶病毒(... 详细信息

钙网蛋白(calreticulin,CRT)在真核生物中广泛表达,是重要的分子伴侣和钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+稳态、钙依赖信号、内质网质量控制、植物生长发育、免疫反应和逆境应答等多种生物学过程。甘蔗(Saccharum ***)中CRT应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)侵染尚未见报道。本研究从热带种Badila(***)中克隆了1个CRT1/CRT2亚型的CRT编码基因,命名为ScCRT1。该基因开放读码框(open reading frame,ORF)长度为1281bp,编码长度为426aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScCRT1具有典型的CRT蛋白结构域,为稳定的亲水性蛋白,其N端有一个信号肽,具有典型的跨膜结构域,C端有典型的内质网定位信号;二级结构多为无规则卷曲;系统进化树分析表明,该蛋白是典型的CRT蛋白,在单子叶和双子叶植物中具有明显的分化。亚细胞定位表明ScCRT1定位于内质网。实时荧光定量PCR分析发现,ScCRT1基因在甘蔗各组织中都有表达,在第8节间中的表达量最低,在心叶中的表达量较高;该基因在SCMV侵染早期表达量上调,后期下调表达。酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验表明,ScCRT1与SCMV-6k2蛋白互作。推测SCMV-6k2通过与ScCRT1互作调控钙离子稳态进而便于SCMV侵染。

关键词：甘蔗钙网蛋白 SCMV 6k2

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NbHAD1基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究

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NbHAD1基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究

作者：赵霞南京农业大学

学位级别：硕士

本氏烟（Nicotiana benthamiana）Haloacid dehalogenase 1（NbHAD1）是卤酸脱卤酶类水解酶家族蛋白,目前对这类家族成员的解析多为其生理生化方面的表征,但是关于其在病毒侵染过程中的功能尚未有报道。为了了解其在病毒侵染过程中的功... 详细信息

本氏烟（Nicotiana benthamiana）Haloacid dehalogenase 1（NbHAD1）是卤酸脱卤酶类水解酶家族蛋白,目前对这类家族成员的解析多为其生理生化方面的表征,但是关于其在病毒侵染过程中的功能尚未有报道。为了了解其在病毒侵染过程中的功能,我们初步开展了系列研究。qRT-PCR分析了NbHAD1基因在病毒侵染前后的表达变化。利用Target P1.1serve信号肽预测软件预测NbHAD1转运肽位置,并利用激光共聚焦显微镜分析了其在细胞内的定位。采用TRV介导的基因沉默技术将本氏烟NbHAD1系统沉默,接种TuMV及其属他病毒如马铃薯X病毒属成员马铃薯X病毒（Potato Virus X,PVX）,烟草花叶病毒属成员辣椒轻斑驳病毒（Pepper Mild Mottle Virus,PMMoV）,分析NbHAD1在病毒侵染过程中的作用。利用PEG介导的方法将病毒质粒转染进沉默NbHAD1的原生质体中,探究NbHAD1沉默后对病毒RNA复制的影响。最后利用双分子荧光光互补（Bimolecular Fluorescence complentmentation,BiFC）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）及酵母双杂交（Yeast two-hybrid,Y2H）技术证明其与病毒蛋白的互作。研究发现TuMV、PVX和PMMoV的侵染导致NbHAD1基因表达下调。NbHAD1定位在叶绿体,去除转运肽后定位在细胞核及细胞膜上。系统沉默NbHAD1的本氏烟对TuMV的侵染产生免疫效果,对PVX和PMMoV的侵染也具有一定的抑制作用。系统沉默NbHAD1的本氏烟植株中TuMV RNA的复制受到抑制且TuMV在本氏烟由下到上的运动受到明显的阻碍。TuMV蛋白6k2与NbHAD1互作。6k2是TuMV侵染后引起宿主内膜重排的关键膜病毒蛋白,诱导宿主内囊泡的产生,产生的囊泡会靶向叶绿体,引起叶绿体聚集及周围6k2长管状结构的产生,包含在核周球状结构中的叶绿体聚集体及长管状结构被证明是病毒RNA复制场所。我们首次发现了属于卤酸脱卤酶水解酶家族的基因NbHAD1在病毒侵染过程中起着一定的作用。证明了 NbHAD1定位于叶绿体,与TuMV蛋白6k2互作,且互作位点位于叶绿体,沉默NbHAD1导致TuMVRNA积累减慢。由此我们猜测叶绿体定位的NbHAD1在TuMV复制过程中起着重要的作用,通过其与6k2蛋白间的互作关系对TuMV的侵染起正调控作用。

关键词： NbHAD1 TuMV 6k2 叶绿体

NbP3IPH在抵抗芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究

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NbP3IPH在抵抗芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究

作者：陈莹沈阳农业大学

学位级别：硕士

芜菁花叶病毒（Turnip Mosaic Virus,TuMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的一员,该属病毒大多是以蚜虫进行非持久方式传播,在多种作物如甘蓝和白菜等均造成重大危害与损失。TuMV为单分子线形正义单链RNA（single-stranded RNA,ssRNA）... 详细信息

芜菁花叶病毒（Turnip Mosaic Virus,TuMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的一员,该属病毒大多是以蚜虫进行非持久方式传播,在多种作物如甘蓝和白菜等均造成重大危害与损失。TuMV为单分子线形正义单链RNA（single-stranded RNA,ssRNA）病毒,编码一个多聚蛋白,并且该多聚蛋白经蛋白酶水解后分为10种病毒蛋白,包括P1、P3、6k1、6k2、HC-Pro、NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CI、CP以及在P3编码区域中的P3N-PIPO蛋白。其中膜蛋白6k2被证实与病毒的复制囊泡相关,通过参与病毒的复制与运动进而达到利于病毒侵染的目的。本研究通过探究本氏烟中一个未知功能蛋白NbP3IPH与TuMV之间的关系,分析其在抵抗TuMV侵染过程中的功能与作用。首先我们通过对NbP3IPH序列和定位情况进行分析,发现NbP3IPH定位于细胞核和细胞膜以及叶绿体,并通过预测软件预测该序列的前32位氨基酸为叶绿体信号肽;并且感染TuMV后诱导NbP3IPH下调表达;其次利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术系统沉默NbP3IPH,研究发现:在沉默植株中NbP3IPH表达量下调60%,植株表型无明显变化,对沉默植株接种TuMV,发现接种叶上病斑数量比对照植株多,病毒积累量增加,表明NbP3IPH沉默有利于TuMV侵染;此外,采用局部超表达NbP3IPH,再摩擦接种TuMV-GFP,结果发现与对照一侧相比,发病症状较轻,病毒积累量较少,说明超表达NbP3IPH不利于TuMV的侵染,表现出对TuMV的抵抗作用。为了进一步分析NbP3IPH与TuMV病毒蛋白之间的关系,我们通过双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence complementation,BiFC）、酵母双杂交（Yeast two hybrid,Y2H）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验证实了NbP3IPH和TuMV 6k2的互作关系。同时,共表达NbP3IPH和6k2使6k2的积累量降低,通过自噬抑制剂3-MA、E64d和PepA处理后,抑制了NbP3IPH介导的对6k2蛋白的降解,并且NbP3IPH可以激活自噬小体的产生,同时利用BiFC和Y2H技术验证了NbP3IPH、6k2与ATG5和ATG8f的互作关系,结合上述结果表明NbP3IPH通过介导自噬途径降解了6k2蛋白。综上所述,本研究明确了本氏烟中一个未知功能蛋白NbP3IPH在参与植物抗TuMV侵染过程中的作用机制。NbP3IPH通过与6k2互作介导自噬途径对其的降解,参与了植物对TuMV侵染的抵抗作用,同时这对于深入理解病毒与寄主互作、病毒致病以及植物抗病毒之间的关系具有重要价值。

关键词：芜菁花叶病毒 NbP3IPH 6k2 蛋白互作自噬