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Nf-κB沉默对鼻咽癌5-8f细胞的生物学作用研究

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NF-κB沉默对鼻咽癌5-8F细胞的生物学作用研究

作者：潘红杰桂林医学院

学位级别：硕士

目的：构建人Nf-κB基因小干扰RNA（siRNA）重组质粒表达载体，沉默人鼻咽癌5-8f细胞中Nf-κB p65基因的表达，探明Nf-κB在鼻咽癌中的生物学作用，为鼻咽癌防治提供实验依据。方法：（1）根据GenBank中人Nf-κB p65的表达序列，设计、... 详细信息

目的：构建人Nf-κB基因小干扰RNA（siRNA）重组质粒表达载体，沉默人鼻咽癌5-8f细胞中Nf-κB p65基因的表达，探明Nf-κB在鼻咽癌中的生物学作用，为鼻咽癌防治提供实验依据。方法：（1）根据GenBank中人Nf-κB p65的表达序列，设计、合成Nf-κB特异性干扰序列（siNf-κB），同时合成阴性序列（HK），合成的干扰序列的正义链和反义链退火合成双链DNA干扰片段,将干扰DNA片段亚克隆到pGenesil-1.2质粒表达载体上,构建重组Nf-κB p65特异性抑制的质粒表达载体pGenesil-1.2-Nf-κB和重组阴性表达质粒载体pGenesil-1.2-HK。（2）将构建的重组质粒表达载体（pGenesil-1.2-Nf-κB、 pGenesil-1.2-HK）分别转入JM109菌株进行扩增培养,提取质粒并纯化。（3）应用脂质体将重组质粒表达载体（pGenesil-1.2-Nf-κB、 pGenesil-1.2-HK）分别转染人鼻咽癌5-8f细胞，显微镜下观察细胞的形态，分析转染效率。（4）实验设空白对照组（未转染载体的5-8f细胞）、阴性对照组（转入pGenesil-1.2-HK质粒表达载体的5-8f细胞），实验组（转入pGenesil-1.2-Nf-κB质粒表达载体的5-8f细胞）。转染48h后采用Western blotting方法检测鼻咽癌细胞中Nf-κB p65基因的蛋白表达水平。采用MTT及流式细胞仪分析Nf-κB沉默对鼻咽癌5-8f细胞的增殖抑制作用以及对细胞周期的影响。结果：（1）成功构建pGenesil-1.2-Nf-κB重组质粒表达载体。（2）与对照组和阴性对照组比较，转入pGenesil-1.2-Nf-κB重组质粒表达载体的5-8f细胞，Nf-κB p65蛋白表达明显下降，对照组与阴性对照组比较，5-8f细胞Nf-κB p65蛋白表达无明显差异。说明Nf-κB p65siRNA能抑制5-8f中Nf-κB p65的表达。（3）转入pGenesil-1.2-Nf-κB重组质粒表达载体的5-8f细胞的细胞增殖抑制率为（58.43±1.24）%，与空白对照组抑制率（0）和阴性对照组抑制率（17.89±4.13）%比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。S期细胞为（42.27±0.39）%，与空白对照组(11.3±0.79）%和阴性对照组（34.88±0.85）%比较，差异具有显著性（P＜0.05），细胞阻滞于S期。结论：成功构建了Nf-κB p65抑制的siRNA质粒表达载体。Nf-κB p65表达抑制，鼻咽癌5-8f细胞的增殖能力下降，细胞周期阻滞在S期。Nf-κB表达在人鼻咽癌细胞的恶性增殖中起重要作用。

关键词：鼻咽癌 5-8f细胞 Nf-κB RNA干扰

新CD44剪接变异体siRNA表达载体构建及其稳定转染5-8f细胞系的建立

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新CD44剪接变异体siRNA表达载体构建及其稳定转染5-8F细胞系的建立

作者：宣广旭桂林医学院

学位级别：硕士

目的:构建CD44新剪接变异体siRNA表达载体质粒,获得质粒稳定转染的人鼻咽癌5-8f细胞系,为研究CD44新剪接变异体在鼻咽癌中的功能提供实验基础。方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGenesil-1.3-kan/Neo表达载体,并测序鉴定。... 详细信息

目的:构建CD44新剪接变异体siRNA表达载体质粒,获得质粒稳定转染的人鼻咽癌5-8f细胞系,为研究CD44新剪接变异体在鼻咽癌中的功能提供实验基础。方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGenesil-1.3-kan/Neo表达载体,并测序鉴定。脂质体法把重组质粒转染至5-8f细胞,通过G418筛选,滤纸法获取单克隆细胞,建立稳定转染的5-8f细胞系。结果:构建了新CD44剪接变异体siRNA重组真核表达载体,获得了G418筛选后的单克隆转染5-8细胞株。结论:成功构建了新CD44剪接变异体siRNA真核表达载体,成功转染到5-8f细胞内,并获得了单克隆细胞株。

关键词：新CD44剪接变异体 siRNA载体构建转染筛选 5-8f细胞

沉默B7-H3表达对鼻咽癌5-8f细胞化疗敏感性的影响

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沉默B7-H3表达对鼻咽癌5-8F细胞化疗敏感性的影响

作者：谭琼南华大学

学位级别：硕士

目的:沉默B7-H3的表达,研究其对鼻咽癌5-8f细胞化疗敏感性的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:1.运用qRT-PCR法检测鼻咽癌5-8f细胞中B7-H3的沉默效率,将5-8f对照组、5-8f-shRNA实验组细胞经顺铂和紫杉醇不同浓度梯和不同时间梯度处理... 详细信息

目的:沉默B7-H3的表达,研究其对鼻咽癌5-8f细胞化疗敏感性的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:1.运用qRT-PCR法检测鼻咽癌5-8f细胞中B7-H3的沉默效率,将5-8f对照组、5-8f-shRNA实验组细胞经顺铂和紫杉醇不同浓度梯和不同时间梯度处理后,通过MTT法检测B7-H3沉默对两组细胞增殖的影响,通过流式细胞技术分析B7-H3沉默对两组细胞凋亡的改变,探讨该分子表达改变对鼻咽癌细胞化疗敏感性的影响。2.通过M6A RNA-seq检测5-8f对照组、5-8f-shRNA实验组细胞的差异表达基因,探讨B7-H3影响鼻咽癌5-8f细胞化疗敏感性的分子机制,采用Western Blot技术,检测两组细胞Caspase-3、Caspase-8的蛋白表达水平。结果:沉默5-8f细胞B7-H3的表达,能显著抑制鼻咽癌5-8f细胞在顺铂和紫杉醇处理后的细胞增殖,促进化疗药物处理后的细胞凋亡;M6A RNA-seq实验检测两组细胞基因表达情况,发现1618个差异表达基因,其中差异所致P值小于0.001的共有232个基因,其中包括Caspase-3、Caspase-8的表达改变。沉默B7-H3的表达后,5-8f细胞经顺铂和紫杉醇药物处理后,Caspase-3、Caspase-8蛋白表达在实验组明显上调。结论:沉默B7-H3表达能增加鼻咽癌5-8f细胞的化疗敏感性,可通过上调Caspase-3和Caspase-8表达促进化疗药物处理后的细胞凋亡。

关键词： B7-H3 鼻咽癌 5-8f细胞化疗敏感性

阿司匹林对鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞增殖、迁移与侵袭作用机制研究

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现代药物与临床 2022年第12期37卷 2673-2679页

作者：马雪百合陈山林王洪凯唐浩张在平桂林医学院广西桂林541199 桂林医学院第二附属医院广西桂林541001

目的探讨阿司匹林对人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞增殖、迁移与侵袭的影响和机制。方法将人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞株分为对照组和阿司匹林(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L)处理组。噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度阿司匹林作用24、48、7... 详细信息

目的探讨阿司匹林对人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞增殖、迁移与侵袭的影响和机制。方法将人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞株分为对照组和阿司匹林(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L)处理组。噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度阿司匹林作用24、48、72 h后对CNE-1、5-8f细胞的增殖能力,以半数抑制浓度(IC50)作为后续实验药物处理浓度。集落形成实验检测CNE-1和5-8f细胞增殖能力,Transwell实验检测CNE-1和5-8f细胞迁移及侵袭能力的变化,Western blotting法检测CNE-1和5-8f细胞中蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Snail蛋白相对表达水平。结果人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞分别经1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L阿司匹林处理后,细胞增殖均受到不同程度抑制,且呈时间及浓度相关性,IC50分别为3.3、2.7 mmol/L。与对照组相比,经阿司匹林处理后,鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞的细胞增殖和集落形成能力明显下降(P5)。Trasnwell迁移实验结果表明,与对照组相比,阿司匹林处理组鼻咽癌细胞CNE-1和5-8f 48 h穿过小室的数目显著减少(P5、0.001)。与对照组相比,阿司匹林处理组CNE-1、5-8f细胞的E-cadherin蛋白表达显著增加(P5),PI3K、Akt、Vimentin、Snail蛋白表达显著下降(P5、0.01)。结论阿司匹林可通过上调E-cadherin蛋白的表达、抑制上皮间质转化进程从而抑制人鼻咽癌CNE-1、5-8f细胞迁移侵袭,同时下调PI3K、Akt、Vimentin、Snail蛋白的表达进而抑制CNE-1、5-8f细胞增殖、迁移和侵袭能力。

关键词：阿司匹林鼻咽癌 CNE-1细胞 5-8f细胞增殖迁移蛋白激酶B 磷脂酰肌醇3-激酶

circHIPK3促进鼻咽癌细胞5-8f迁移和侵袭的机制

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安徽医科大学学报 2023年第8期58卷 1346-1353页

作者：邵文婷吕磊高劲皖南医学院研究生学院芜湖240001 中国科学技术大学附属第一医院西区肿瘤表观遗传学实验室合肥230031 中国科学技术大学附属第一医院西区放射治疗科合肥230031

目的探讨环状RNA HIPK3(circHIPK3)在鼻咽癌(NPC)细胞迁移和侵袭中的作用及其分子机制。方法检索公共数据库,运用高通量基因表达数据库(GEO)分析NPC组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;合成circHIPK3-siRNA转染NPC 5-8f细胞;采用RT-qPCR... 详细信息

目的探讨环状RNA HIPK3(circHIPK3)在鼻咽癌(NPC)细胞迁移和侵袭中的作用及其分子机制。方法检索公共数据库,运用高通量基因表达数据库(GEO)分析NPC组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;合成circHIPK3-siRNA转染NPC 5-8f细胞;采用RT-qPCR、Western blot、细胞划痕、CCK-8和Transwell等实验方法,研究确定circHIPK3-siRNA干扰效果后,检测它对细胞增殖、迁移和侵袭及潜在下游基因CDH1、CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3表达的影响。运用转录组测序技术分析5-8f细胞circHIPK3-siRNA干扰后显著差异表达的基因,以期找到介导circHIPK3促癌作用的关键基因。结果与非癌组织相比,NPC组织中circHIPK3表达明显增加(P5)。使用siRNA特异性敲低5-8f细胞中circHIPK3的表达后,与对照组相比,si-circHIPK3组细胞增殖速率降低(P5),si-circHIPK3组细胞划痕闭合率降低(P细胞迁移和侵袭的细胞数目减少(P5)。此外,与对照组相比,si-circHIPK3组下游基因CDH1 mRNA和蛋白的表达量升高(P5)。进一步测序分析显示,circHIPK3-siRNA转染的5-8f细胞中AL645922.1、SCO_(2)、AL136295.1和ISY1-RAB43表达上调(P5),BIVM-ERCC5、fAM47E-STBD1、INO80B-WBP1、NAIP、C15orf38-AP3S2、BCL2L2-PABPN1和SMIM11B表达下调(P5)。结论NPC组织中circHIPK3表达显著升高。circHIPK3通过调节E-Cadherin、N-Cadherin、MMP2、MMP9和IL-6/STAT3的表达,促进NPC细胞5-8f的增殖、迁移和侵袭。AL645922.1和BIVM-ERCC5等基因可能在circHIPK3介导的促进NPC 5-8f细胞迁移和侵袭中发挥关键作用。

关键词： circHIPK3 5-8f细胞鼻咽癌迁移和侵袭转录组测序

姜黄素下调Tiam1表达抑制鼻咽癌细胞5-8f增殖与侵袭

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姜黄素下调Tiam1表达抑制鼻咽癌细胞5-8F增殖与侵袭

作者：陈娟南华大学

学位级别：硕士

目的:观察Tiam1蛋白在鼻咽癌组织中表达情况及临床病理意义,探究姜黄素对鼻咽癌5-8f细胞增殖、侵袭和转移的影响及机制。方法:1.通过免疫组化法检测57例不同病理类型鼻咽癌组织及10例鼻咽黏膜慢性炎症组织中Tiam1表达情况,分析Tiam1表... 详细信息

目的:观察Tiam1蛋白在鼻咽癌组织中表达情况及临床病理意义,探究姜黄素对鼻咽癌5-8f细胞增殖、侵袭和转移的影响及机制。方法:1.通过免疫组化法检测57例不同病理类型鼻咽癌组织及10例鼻咽黏膜慢性炎症组织中Tiam1表达情况,分析Tiam1表达与鼻咽癌临床病理特征之间相关性;2.利用CCK8法检测鼻咽癌5-8f细胞在不同姜黄素浓度处理后增殖活力变化。本实验设置姜黄素药物处理5个浓度组(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L)、空白对照组及DMSO溶剂对照组,分别作用24、48、72h三个时间点后检测5-8f细胞增殖活力变化并绘制姜黄素对细胞增殖活力的浓度-时间关系图表,根据CCK-8实验结果选择0μmol/L、20μmol/L、60μmol/L、100μmol/L药物浓度组进行划痕实验、Transwell、Western blot实验;3.划痕实验观察不同浓度姜黄素处理5-8f细胞24h后迁移能力变化;***实验观察各实验组细胞在体外穿膜至小室下层细胞数目,了解姜黄素处理后对细胞体外侵袭能力的影响;5.运用Western blot免疫印迹法检测空白对照组及3个实验组细胞在处理24h后Tiam1蛋白含量。结果:1.免疫组化结果示:不同病理类型的鼻咽癌组织中Tiam1表达(36/57 63.2%)高于鼻咽黏膜慢性炎症组织(1/9 10%)(P5);Tiam1阳性表达率与性别、年龄无相关性,所选病例中分期越晚,病理类型分化程度越低,Tiam1蛋白表达率越高,且所有存在远处转移的病例均高表达Tiam1蛋白(P5);***-8实验结果示姜黄素能体外抑制鼻咽癌5-8f细胞增殖,随着姜黄素药物浓度增加,作用时间延长,实验组中5-8f细胞抑制越显著,5-8f细胞增殖与姜黄素作用存在浓度和时间依赖性;3.划痕实验及Transwell实验结果说明,实验组细胞药物处理24h后,迁移距离及穿膜细胞数明显低于空白对照组,姜黄素可体外抑制5-8f细胞的迁移及侵袭能力(P5);*** blot法检测不同浓度姜黄素处理5-8f细胞24小时后Tiam1蛋白变化,结果示空白组Tiam1蛋白表达含量明显高于实验组,在实验组中,20μmol/L组蛋白表达量最高,100μmol/L组Tiam1蛋白表达量低于60、20μmol/L组(P5)。结论:***1蛋白在鼻咽癌组织中表达高于鼻咽黏膜慢性炎症组织,Tiam1表达与患者T分期、组织分化程度、淋巴结远处转移存在相关性;2.姜黄素可能通过抑制Tiam1蛋白表达,降低5-8f细胞增殖、侵袭与转移能力。

关键词：鼻咽癌组织 5-8f细胞姜黄素 Tiam1 细胞增殖侵袭与转移

CircHIPK3促进鼻咽癌细胞5-8f转移的机制研究

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CircHIPK3促进鼻咽癌细胞5-8F转移的机制研究

作者：邵文婷皖南医学院

学位级别：硕士

目的:探讨circHIPK3在鼻咽癌转移中的作用和分子机制。方法:(1)首先检索公共数据库,运用生信分析鼻咽癌组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;(2)通过体外培养鼻咽癌5-8f细胞,采用RT-q PCR和Western blot、细胞划痕、CCK-8、Transwell实... 详细信息

目的:探讨circHIPK3在鼻咽癌转移中的作用和分子机制。方法:(1)首先检索公共数据库,运用生信分析鼻咽癌组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;(2)通过体外培养鼻咽癌5-8f细胞,采用RT-q PCR和Western blot、细胞划痕、CCK-8、Transwell实验等方法研究circHIPK3-siRNA干扰后对细胞迁移和侵袭及潜在下游基因E-Cadherin/CDH1、N-Cadherin/CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3表达的影响。(3)最后,运用转录组测序技术分析5-8f细胞circHIPK3-siRNA干扰后显著差异表达的基因。结果:(1)与非癌组织相比,鼻咽癌组织中circHIPK3表达明显增加。(2)与Control组相比,circHIPK3-siRNA转染组5-8f细胞circHIPK3表达明显下调,划痕闭合率明显降低,迁移侵袭细胞数目明显减少,E-Cadherin m RNA和蛋白量明显升高,N-Cadherin、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3 m RNA和蛋白量明显降低。(3)进一步分析显示,circHIPK3-siRNA转染组5-8f细胞中AL645922.1、SCO2、AL136295.1和ISY1-RAB43表达显著上调,BIVM-ERCC5、fAM47E-STBD1、INO80B-WBP1、NAIP、C15orf38-AP3S2、BCL2L2-PABPN1和SMIM11B表达显著下调。结论:鼻咽癌组织中circHIPK3表达显著升高。CircHIPK3通过调节E-Cadherin、N-Cadherin、MMP2、MMP9和IL-6/STAT3的表达,促进鼻咽癌细胞5-8f转移。AL645922.1和BIVM-ERCC5等基因可能在circHIPK3介导的鼻咽癌5-8f细胞转移中发挥关键作用。

关键词： circHIPK3 5-8f细胞鼻咽癌转移转录组测序

自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8f存活、凋亡的影响及其机制

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山东医药 2023年第36期63卷 31-36页

作者：韩蜜龙远雄湖南省肿瘤医院药学部长沙410013 湖南中医药大学第一附属医院科研部

目的观察自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8f存活、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将对数生长期5-8f细胞分为8组,5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清... 详细信息

目的观察自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8f存活、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将对数生长期5-8f细胞分为8组,5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清,20%空白血清组加入20%不含药血清,对照组细胞正常培养,培养24、48 h,CCK-8法检测各组细胞存活率。将对数生长期5-8f细胞分为4组,低剂量组加入5%鼻咽解毒胶囊含药血清,中剂量组加入20%鼻咽解毒胶囊含药血清,高剂量组加入30%鼻咽解毒胶囊含药血清,阴性组细胞正常培养,培养24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-qPCR法检测细胞中K-RAS、RAf mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞中K-RAS、RAf、p-ERK1/2蛋白相对表达量。结果与对照组比较,20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组培养24 h及48 h的细胞存活率降低(P均5);与20%空白血清组比较,25%含药血清组培养48 h和30%含药血清组培养24、48 h的细胞存活率降低(P均5);与同组24 h比较,30%含药血清组培养48 h的细胞存活率降低(P5)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率升高(P均5);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组细胞凋亡率升高(P均5);与中剂量组比较,高剂量组细胞凋亡率升高(P5)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组的K-RAS、RAf mRNA相对表达量降低(P均5);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组K-RAS、RAf mRNA相对表达量降低(P均5);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAf mRNA相对表达量降低(P均5)。与阴性组比较,高剂量组K-RAS蛋白、RAf蛋白、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低,中剂量组的K-RAS、RAf蛋白相对表达量降低,低剂量组RAf蛋白相对表达量降低(P均5);与低剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAf、p-ERK1/2蛋白相对表达量及中剂量组K-RAS、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低(P均5);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS蛋白相对表达量降低(P5)。结论自制鼻咽解毒胶囊含药血清能抑制5-8f细胞存活,并促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性,尤以30%鼻咽解毒胶囊含药血清剂量为最佳,作用机制可能与其可抑制MAPK/ERK信号通路有关。

关键词：鼻咽解毒胶囊鼻咽癌 5-8f细胞细胞凋亡 MAPK/ERK信号通路

小干扰RNA抑制内源性原癌基因c-myc表达对鼻咽癌细胞5-8f的影响

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新乡医学院学报 2015年第7期32卷 614-618页

作者：牛朝霞李宜培陈洁杨红梅王黎河南医学高等专科学校病理生理学教研室河南郑州451191

目的通过RNA干扰抑制鼻咽癌5-8f细胞内源性原癌基因c-myc的过表达,观察c-myc过表达受到抑制后对5-8f细胞生物学特性的影响。方法构建针对c-myc的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染5-8f细胞,建立稳定转染... 详细信息

目的通过RNA干扰抑制鼻咽癌5-8f细胞内源性原癌基因c-myc的过表达,观察c-myc过表达受到抑制后对5-8f细胞生物学特性的影响。方法构建针对c-myc的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染5-8f细胞,建立稳定转染干扰组细胞5-8f/si-c-myc;同法建立阴性对照组细胞5-8f/si-control,并以5-8f为空白对照组细胞;通过半定量反转录聚合酶链反应和Western blot分别检测c-myc mRNA和蛋白水平表达,鉴别干扰效果;通过四甲基偶氮唑蓝比色法检测干扰前后对5-8f细胞生长的影响;通过流式细胞仪分析干扰前后对5-8f细胞周期的影响;通过透射电镜扫描观察干扰前后对5-8f细胞超微结构的影响。结果与空白对照组和阴性对照组细胞相比,干扰细胞组c-myc mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P5),细胞生长活力显著降低(P5),细胞周期G0/G1期细胞比例显著升高(P5),S期细胞比例显著降低(P5),细胞超微结构发生明显改变。结论干扰内源性c-myc的siRNA能显著抑制5-8f的细胞生长和细胞分裂增殖,c-myc基因有可能成为鼻咽癌基因治疗新靶点。

关键词： RNA干扰原癌基因c-myc 细胞生长 5-8f细胞鼻咽癌