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中国农业科技导报 2018年第6期20卷 11-18页

作者：陈茂然梁秋菊张春义中国农业科学院生物技术研究所北京100081

叶酸属于维生素B族(B9),包括四氢叶酸及其多种衍生物。叶酸作为一碳代谢的辅因子,参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)催化贮存形式的叶酸衍生物5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活跃的叶酸衍生物转化。对玉米5... 详细信息

叶酸属于维生素B族(B9),包括四氢叶酸及其多种衍生物。叶酸作为一碳代谢的辅因子,参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)催化贮存形式的叶酸衍生物5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活跃的叶酸衍生物转化。对玉米5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(Zm5FCL)进行基因克隆和功能分析,发现Zm5FCL蛋白包含保守的5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase superfamily结构域。通过将该蛋白在大肠杆菌中进行异源表达、纯化及体外酶活性分析,表明Zm5FCL能够催化5-CHO-THF向5,10-次甲基四氢叶酸(5,10-CH=THF)转化。进一步在拟南芥5fcl突变体中进行Zm5FCL过表达分析表明,Zm5FCL能够代谢突变体中的5-CHO-THF向5,10-CH=THF和5-甲基四氢叶酸(5-CH_3-THF)的转化。上述结果表明Zm5FCL在叶酸代谢中执行保守的生物学功能,推测其在玉米叶酸代谢中发挥着重要作用。

关键词：叶酸叶酸代谢 5-甲酰四氢叶酸环化连接酶

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玉米5-甲酰四氢叶酸环化连接酶基因的克隆及其在叶酸代谢调控中的功能研究

玉米5-甲酰四氢叶酸环化连接酶基因的克隆及其在叶酸代谢调控中的...

引用

作者：陈茂然中国农业科学院

学位级别：硕士

叶酸作为介导一碳代谢的重要辅因子,参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)被报道催化贮存形式的5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活性形式的叶酸转化,本文对玉米中的5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)进行了克隆... 详细信息

叶酸作为介导一碳代谢的重要辅因子,参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)被报道催化贮存形式的5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活性形式的叶酸转化,本文对玉米中的5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)进行了克隆和功能分析。通过体外酶活分析及在拟南芥中过表达实验验证了其蛋白功能,分析了玉米中Zm5FCL的表达模式和亚细胞定位,并对玉米胚和胚乳中叶酸的分布及叶酸合成、代谢基因的表达模式进行了分析,取得的主要研究结果如下:1、基于拟南芥At5FCL的蛋白序列,我们从玉米中克隆了其同源蛋白(GI:GRMZM5G807835),命名为Zm5FCL。与番茄和拟南芥5FCL蛋白序列比对,结果显示序列相似度分别达到53.07%和52.38%,与人类、酵母、细菌的相似度分别达到22%-28%。Zm5FCL蛋白中包含5-formyltetrahydrofolate cycloligase结构域,推测其可能存在功能的保守性。2、Zm5FCL体外蛋白酶活测定及其在拟南芥5fcl突变体和野生型中的过表达分析结果显示:体外酶活体系中Zm5FCL蛋白能够将5-CHO-THF转化为5,10-次甲基四氢叶酸(5,10-CH=THF);在5fcl突变体中过表达Zm5FCL后,突变体叶片中5-CHO-THF含量恢复到野生型水平,说明Zm5FCL能够互补At5FCL的功能;在野生型拟南芥中过表达Zm5FCL时,叶片中的5-CHO-THF显著降低。3、利用玉米原生质体瞬时表达分析显示,初步判定Zm5FCL::GFP融合蛋白定位于细胞质中。在玉米籽粒发育过程中,Zm5FCL基因在胚中的表达量明显高于胚乳。叶酸水平检测分析显示,5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)含量在胚和胚乳之间存在存在显著差异,胚中明显高于胚乳,而胚和胚乳中的5-CHO-THF含量没有明显差异。4、通过对胚和胚乳中叶酸合成及一碳代谢相关基因的转录水平进行分析,发现ZmGTPCHI-2,ZmGDCH-1,ZmGDCT,ZmDHC5,Zm10-FDF,Zm5FCL六个基因在胚中表达水平明显高于胚乳,ZmDHNA1,ZmHPPK,ZmADCL2,Zm DHFR-1,ZmDHFR-2,ZmDHFR-4,ZmGDCH-4,ZmGDCP,ZmDHC1,ZmDHC4,ZmMTHFR1,ZmMTHFR2在胚乳中的表达水平明显高于胚,这些结果说明玉米胚和胚乳中叶酸的合成和分布存在着不同的调控机制。

关键词：叶酸叶酸代谢 5-甲酰四氢叶酸环化连接酶玉米

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