检索结果-南通市图书馆

作者：卢晓明山东农业大学

学位级别：硕士

大蒜(Allium Sativum L.)为百合科葱属多年生草本植物，其营养价值较高，风味独特，具有广泛的用途。大蒜在生产加工过程中常会出现绿变现象，严重地影响了产品外观和品质，妨碍了开拓大蒜精深加工和高附加值市场，造成大蒜加工企业严... 详细信息

大蒜(Allium Sativum L.)为百合科葱属多年生草本植物，其营养价值较高，风味独特，具有广泛的用途。大蒜在生产加工过程中常会出现绿变现象，严重地影响了产品外观和品质，妨碍了开拓大蒜精深加工和高附加值市场，造成大蒜加工企业严重的经济损失。目前，对大蒜绿变机理的研究主要集中在采用体外模拟化学合成或通过化学方法等途径，不能有效的揭示大蒜绿变的分子途径。已有研究表明大蒜绿色素含有吡咯环，但其生成途径未知。因此，从分子水平上对与吡咯基化合物合成相关酶的基因的研究对阐明绿变机理具有重要的意义。本试验以大蒜为原料，成功克隆到邳州白蒜生成吡咯基化合物PBG的重要酶5-氨基酮戊酸脱水酶的部分cDNA序列，并对不同温度、不同品种下该基因进行了表达特性分析、活性测定及PBG含量、绿变强度的研究，探讨了ALAD与大蒜绿色素生物合成途径的关系。主要研究结果如下： 1.根据GenBank中登记的其他植物氨基酸的保守序列设计兼并引物并通过RT-PCR和RACE技术从大蒜中克隆到了部分ALAD基因，长度为1251bp，编码400个氨基酸。 2对室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜进行ALAD基因表达和酶活性测定后显示：室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD基因表达没有明显差别，而活性差距较大，可知ALAD酶活性存在转录后水平的调节，存在品种差异。 3对低温(4℃)和室温(235℃)下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜进行ALAD基因表达、酶活性、PBG含量及大蒜绿变强度测定后发现：低温(4℃)对大蒜ALAD基因表达存在一定影响，4℃下邳州白蒜最大表达量约为对照组14.2倍，苍山蒲棵大蒜约为对照组1.9倍。ALAD活性变化与PBG含量及大蒜绿变一致，ALAD合成大蒜体内吡咯基化合物PBG，与大蒜绿变密切相关。

关键词：大蒜绿变强度 5-氨基酮戊酸脱水酶胆色素原克隆表达

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含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达

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安徽农业大学学报 2006年第4期33卷 496-498页

作者：朱娟范军朱苏文程备久安徽农业大学生命科学学院合肥230036

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在I... 详细信息

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 ***-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活。

关键词： 5-氨基酮戊酸脱水酶枯草杆菌高效表达组氨酸标签

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含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶性质研究

含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶性质研究

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作者：朱娟安徽农业大学

学位级别：硕士

所有四吡咯化合物如血红素、叶绿素和维生素B12等对大部分生物体有非常重要的作用,它们合成的第一个共有底物是5-氨基酮戊酸。共有反应的第一步是两分子的5-氨基酮戊酸缩合成一分子的胆色素原,由5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate d... 详细信息

所有四吡咯化合物如血红素、叶绿素和维生素B12等对大部分生物体有非常重要的作用,它们合成的第一个共有底物是5-氨基酮戊酸。共有反应的第一步是两分子的5-氨基酮戊酸缩合成一分子的胆色素原,由5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase,ALAD),又名胆色素原合酶的酶所催化。已从数个物种中纯化了ALAD,它是一个金属蛋白,不同生物中的ALAD依赖不同的金属离子。在微生物和哺乳动物中,ALAD是同源八聚体,在植物中是六聚体。已从近百个物种中克隆了ALAD的基因,所有物种的ALAD的氨基酸序列比对显示有约35%的同源性。利用重组技术定点突变确定了数个物种ALAD起催化作用的必需氨基酸残基。数个物种的ALAD的晶体结构显示酶活中心高度保守。枯草杆菌的ALAD基因和大肠杆菌的基因高度保守,但枯草杆菌的ALAD酶活中心的保守氨基酸序列和大肠杆菌略有不同。迄今未有枯草杆菌ALAD性质的报道。ALAD催化合成的产物PBG,不仅可以用于后续的酶活分析,而且也是癌症药物的前体。本实验从枯草杆菌克隆ALAD基因,在大肠杆菌中表达并测定其酶学性质,研究内容及结果如下:1.重组枯草杆菌ALAD表达载体的构建以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR方法扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因(hemB)。测序结果和报道的枯草杆菌hemB序列一致。将Nde I和EcoR I双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体。2.5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达与一步纯化构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,0.5 mmol/L的IPTG下诱导5 h,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为164 U·mg-1,表明酶以活性形式表达,组氨酸标签不显著影响酶活。利用ALAD加在N端的组氨酸标签,通过Ni-NTA进行纯化,SDS-PAGE表明可纯化至均一。3.5-氨基酮戊酸脱水酶的酶学性质枯草杆菌ALAD的酶的亚基分子质量约为41 kDa,全酶分子量为330 kDa,表明酶由8个同亚基寡蛋白组成;最适pH为8.0;动力学参数Km为7.4 mmol,Vmax为0.54 mmol·h-1;在55℃温浴10 min,保留85%的酶活,表明热稳定性较好;添加金属离子如K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+都显著地增加了酶活力,最高达将近200%,Cu2+和Hg2+却显著地抑制了酶活。随β-巯基乙醇浓度的增加至10 mmol/L,酶活随之增加,β-巯基乙醇保护催化产物免于氧化。高浓度的还原剂二硫苏糖醇抑制酶活,推测它影响酶活中心半胱氨酸和金属离子的结合。数个氨基酸修饰剂的修饰结果表明,赖氨酸和半胱氨酸残基是酶催化必需的,而组氨酸和丝氨酸残基修饰仍然有一定酶活,主要是修饰剂改变了酶的空间结构。

关键词：枯草杆菌 5-氨基酮戊酸脱水酶组氨酸标签酶学性质

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重组枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的纯化和性质研究

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激光生物学报 2009年第2期18卷 156-160页

作者：朱娟朱苏文程备久范军安徽农业大学生命科学院

大肠杆菌中表达的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶（5-aminolevulinate dehydratase，ALAD），其N端含有组氨酸标签，Ni—NTA一步纯化至均一。纯化的酶比活为3．6U／mg蛋白，酶的最适pH为8．0—10．0，Km为0．95mmol～Vmax为16．7mmol/h，... 详细信息

大肠杆菌中表达的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶（5-aminolevulinate dehydratase，ALAD），其N端含有组氨酸标签，Ni—NTA一步纯化至均一。纯化的酶比活为3．6U／mg蛋白，酶的最适pH为8．0—10．0，Km为0．95mmol～Vmax为16．7mmol/h，在55℃温浴10min，酶活保留85％，2mmol／L的K^＋、Zn^2＋、Mg^2＋、Li^＋、Fe^3＋和Mn^2＋提高酶活，2mmol／L的Co^2＋和Ca^2＋对酶活没有显著影响，2mmol/L的Cu^2＋和1mmol/L的Hg^2＋完全抑制酶活。在2mmol/L的EDTA存在下酶活性丧失，表明酶催化依赖金属离子。100mmol／L的酮戊酸抑制酶活约50％。10mmoL／L的2-巯基乙醇时提高酶活3倍，而100mmol/L的二硫苏糖醇几乎完全抑制酶活。氨基酸修饰表明赖氨酸和半胱氨酸残基可能是酶催化必需的，组氨酸和丝氨酸残基对酶催化不起关键作用。

关键词： 5-氨基酮戊酸脱水酶枯草杆菌组氨酸标签酶学性质

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