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中国生物防治学报 2020年第5期36卷 721-728页

作者：汪章勋徐秀珍冯健雨周权黄勃植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室/安徽农业大学植物保护学院合肥230036 安徽农业大学微生物防治省重点实验室合肥230036

本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象,针对5′-3′核糖核酸外切酶基因(MrXrn1,MAA_09154,5′-3′exoribonuclease 1),利用农杆菌介导的同源重组方法进行基因敲除。对获得的MrXrn1基因敲除株(ΔMrXrn1)与野生型进行表型分析结果发现,与野生... 详细信息

本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象,针对5′-3′核糖核酸外切酶基因(MrXrn1,MAA_09154,5′-3′exoribonuclease 1),利用农杆菌介导的同源重组方法进行基因敲除。对获得的MrXrn1基因敲除株(ΔMrXrn1)与野生型进行表型分析结果发现,与野生型相比,ΔMrXrn1的营养生长无明显变化,而产孢能力显著下降,其中产孢量降低了75.75%;以大蜡螟为试虫的体壁侵染毒力分析显示ΔMrXrn1的毒力显著减少,也即半致死时间(LT50:9.16 d)显著长于野生型的(5.96 d),但注射接种情况下不同菌株的毒力无差异;进一步的研究表明ΔMrXrn1的附着孢形成率降低了43.58%。这些结果说明MrXrn1基因对绿僵菌的产孢及毒力起着重要的调控作用。本研究为进一步有效提高真菌杀虫剂的生防效果提供了基础。

关键词：绿僵菌 5′-3′核糖核酸外切酶基因敲除基因功能

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毕赤酵母表达XRN1蛋白及响应面法优化基础盐发酵培养基

毕赤酵母表达XRN1蛋白及响应面法优化基础盐发酵培养基

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作者：吴迎春浙江理工大学

学位级别：硕士

5′-3′核糖核酸外切酶（XRN1）是一个在基因表达过程中与RNA代谢和RNA干扰等重要功能相关的保守酶大家族，存在于所有真核生物中，简称5PX。XRN1能持续降解5′端单磷酸的RNA，而不能对5′端三磷酸、5′帽子结构、5′羟基的RNA发挥作用... 详细信息

5′-3′核糖核酸外切酶（XRN1）是一个在基因表达过程中与RNA代谢和RNA干扰等重要功能相关的保守酶大家族，存在于所有真核生物中，简称5PX。XRN1能持续降解5′端单磷酸的RNA，而不能对5′端三磷酸、5′帽子结构、5′羟基的RNA发挥作用。在总RNA中，rRNA含量最高，原核生物的16S与23S rRNA和真核生物18S与28S rRNA5′端均为单磷酸，末端核酸外切酶XRN1可将这些rRNA降解去除，而达到富集mRNA的目的。已知酿酒酵母S288c的Xrn1基因序列长4587bp，编码1528aa。通过生物学软件对其蛋白分子量和等电点进行预测，得出分子量约为175kDa，等电点在7.3左右。本论文利用毕赤酵母表达系统重组表达酿酒酵母S288c的XRN1，筛选高效表达XRN1重组蛋白的体系，同时优化基础盐发酵培养基，进行扩大培养及诱导表达，并分离纯化重组蛋白，鉴定重组酶活性，为mRNA的富集奠定基础。通过构建真核表达载体pPIC3.5K-Xrn1，重组载体经SaI I线性化后，电击转入毕赤酵母GS115，然后通过甲醇诱导实现了XRN1蛋白在毕赤酵母中的胞内表达。结果表明酵母胞内表达重组菌可以表达全长XRN1重组蛋白，经Westernblotting鉴定其大小约为175kDa，与目的蛋白大小基本相符。用Bradford法可测纯化浓缩后的真核蛋白酶液的浓度;活性检测表明，此重组蛋白具有5′-3′核糖核酸酶活性。最后利用响应面法对毕赤酵母初始盐发酵培养基进行优化。首先应用Plackett-Burman(PB)设计法对影响XRN1蛋白表达的发酵培养基组分进行筛选，选取的8个相关因子为：酵母提取物、硫酸钙、MgSO4·7H2O、甘油、硫酸钾、磷酸、硫酸铵和氢氧化钾。统计分析表明，影响XRN1蛋白表达的关键因子为酵母提取物、硫酸镁和硫酸钾。再进行最陡爬坡试验逼近3个关键因素的最大响应区域的基础上，采用Box-Behnken Design法对发酵培养基组分进行优化，其最佳条件为酵母提取物0.45%、硫酸镁0.38%和硫酸钾1.4%。在最佳培养条件下，工程菌生物量增加约0.5倍，蛋白表达量提高近40%。

关键词： 5′-3′核糖核酸外切酶 XRN1蛋白毕赤酵母表达响应面分析

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