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β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′race扩增及序列分析

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生物技术通讯 2010年第2期21卷 192-195页

作者：王鑫张莹何金生北京交通大学生物科学与技术研究所北京100044

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′race法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基... 详细信息

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′race法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′race法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。

关键词： β淀粉样肽单克隆抗体可变区序列 5’race

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列race扩增方法的建立

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中国兽医科学 2006年第2期36卷 151-156页

作者：唐博曹贵方杨银凤王秀梅内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR race技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 c... 详细信息

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR race技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR race技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,race技术用于防御素基因的扩增是可行的。

关键词： β-防御素 3’race 5’race 锚定PCR 反向嵌套PCR 骆驼

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

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农业生物技术学报 2012年第1期20卷 85-93页

作者：李伟吴苏君杨文琳史芸安井勇赵贵民云彦雷安民西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西省农业分子生物学重点实验室

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,Hlfoo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用。本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体。首先... 详细信息

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,Hlfoo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用。本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体。首先利用5’race和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位。序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7%、67.9%和54.3%;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在Hela细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venus mRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核。本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venus mRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料。

关键词： H1foo基因 5’race 体外转录显微注射猪卵母细胞

朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建

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华北农学报 2010年第2期25卷 30-34页

作者：王磊钟鸣郭志富张丽张佳赵莉李浩戈沈阳农业大学辽宁省农业生物技术重点实验室辽宁沈阳110161

采用改良的RT-PCR及5′race法,成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA 5′端序列,与已知序列拼接,获得了BADHcDNA全长1781bp,包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。其含有醛脱氢酶高度保守序列VT/SLELGGKSP,及其... 详细信息

采用改良的RT-PCR及5′race法,成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA 5′端序列,与已知序列拼接,获得了BADHcDNA全长1781bp,包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。其含有醛脱氢酶高度保守序列VT/SLELGGKSP,及其后29位与酶功能有关的Cys。多序列比对和系统进化分析表明,朝鲜碱茅BADH与大麦BBD1同源性最高,并构建了PBI121-BADH植物表达载体。

关键词：朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶 5’race 高GC 表达载体

骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

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中国预防兽医学报 2005年第4期27卷 264-268页

作者：杨银凤唐博曹贵方王永胜内蒙古农业大学动物胚胎与发育生物学研究室内蒙古呼和浩特010018 乌兰察布盟农牧学校内蒙古乌兰察布012000

获得全长cDNA序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提。我们根据已获得的骆驼β_防御素caBD_1cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列。另外,采用反向嵌套PCRrace法,根据caBD_1cDNA的已知序列,设... 详细信息

获得全长cDNA序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提。我们根据已获得的骆驼β_防御素caBD_1cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列。另外,采用反向嵌套PCRrace法,根据caBD_1cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β_防御素caBD_1cD NA的5′末端序列。本研究扩增出的caBD_1cDNA序列全322bp,其中包含一个由192bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD_1肽。

关键词：反向嵌套PCR 5’race 3’race β-防御素骆驼

Identification and characterization of miRNA transcriptome in rhizome of Oryza longistaminata by high-throughput sequencing

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Identification and characterization of miRNA transcriptome i...

广西巴马小型猪Tau基因可变剪接体的克隆和鉴定

第十四届全国植物基因组学大会

作者： Ying Zong Ting Zhang Liyu Hang Wensheng Wang Binying Fu Institute of Crop Sciences Chinese Academy of Agricultural Sciences

In plants,endogenous small RNAs,including microRNAs(miRNAs) and trans-acting small interfering RNAs play an important role in biological processes such as development and stress *** the diverse functions of miRNAs in ... 详细信息

关键词： Oryza longistaminata deep sequencing miRNA Northern blot 5’race

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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广东农业科学 2013年第7期40卷 127-129页

作者：陈少梅陈宝剑苏秀珍杨秀荣蒋钦杨兰干球蒋和生郭亚芬广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 中国东盟(广西)生物技术合作研发中心/广西科学院广西南宁530007

为研究广西巴马小型猪‰基因可变剪接体序列，根据NCBI中预测的猪‰基因序列设计引物，利用巢式PCR和5’race方法克隆并验证‰基因。结果显示：广西巴马小型猪Tan基因与参考序列相比存在3处缺失，分别为191～277、344～1389、1526～157... 详细信息

为研究广西巴马小型猪‰基因可变剪接体序列，根据NCBI中预测的猪‰基因序列设计引物，利用巢式PCR和5’race方法克隆并验证‰基因。结果显示：广西巴马小型猪Tan基因与参考序列相比存在3处缺失，分别为191～277、344～1389、1526～1579bp。3处缺失形成4条Tau基因的可变剪接体，其序列长度分别为1302、1215、1356、1269bp，提交至GenBank获得登录号分别为KC473498、KC473499、KC473500、KC473501。

关键词：广西巴马小型猪 Tau基因 5’race 可变剪接体

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)诱导的水稻早期反应基因ER1的5’端cDNA片段克隆及序列分析

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植物生理学报（0257-4829) 1999年第4期25卷 413-416页

作者：周建明朱群白永延中国科学院上海植物生理研究所上海200032 SalkInstituteforBiologicalStudies

The 5’ end cDNA fragment(ER1’) of early responsive gene(ER1) of rice(Oryza sativa L. subsp. japonica No.4) induced by blast fungus M. grisea has been isolated and sequenced (606 bp) by 5’race technique(Fig. 2). DNA sequence analysis showed that ER1’ (606 bp) can encode 134 amino acids and there are 309 bp nucleotides located at the 3’ end of the untranslated region of mRNA of ER1 gene(Fig. 3). The 89 bp overlapping fragment was found between the 5’ end of ER1 cDNA fragment and the 3’ end of ER1’(Fig. 3). The partial identities of amino acid sequence deduced from ER1’ with an unknown protein(gene accession number AC002409) of Arabidopsis thaliana was 82%(Fig. 4).

关键词：水稻稻瘟病菌 ER1基因 5'cDNA片段 5’race

玉米幼穗授粉前后microRNAs高通量测序鉴定与分析

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玉米幼穗授粉前后microRNAs高通量测序鉴定与分析

作者：王虹麟安徽农业大学

学位级别：硕士

MicroRNAs（miRNA）是一类约20-22nt的非编码RNA,其在动物和植物的许多生物过程中都起到了关键作用。虽然在玉米中已鉴定了许多miRNA,但对于miRNA在玉米幼穗发育过程中的功能研究较少。通过鉴定参与玉米幼穗发育的miRNA,特别是鉴定玉米... 详细信息

MicroRNAs（miRNA）是一类约20-22nt的非编码RNA,其在动物和植物的许多生物过程中都起到了关键作用。虽然在玉米中已鉴定了许多miRNA,但对于miRNA在玉米幼穗发育过程中的功能研究较少。通过鉴定参与玉米幼穗发育的miRNA,特别是鉴定玉米生殖发育前期和生殖发育后期与籽粒灌浆初期的阶段的miRNA,将为我们对玉米幼穗发育的生理基础的研究奠定理论基础。本研究以玉米自交系许178和掖478为材料,通过小RNA深度测序鉴定玉米幼穗授粉前后发育相关的已知miRNA和新的miRNA,并通过软件预测新miRNA的靶基因,利用RLM-race和荧光定量PCR方法进行了验证。主要结果如下:（1）通过对玉米自交系许178和掖478幼穗授粉前和授粉后十天的4个小RNA文库的高通量测序结果分析,在许178授粉前（xu178BP）,许178授粉后十天（xu17810DAP）,掖478授粉前（ye479BP）和掖478授粉后十天（ye478 10DAP）的玉米幼穗中分别产生了 21,070,902、21532706、21,070,902和21532706个干净读数。在xu178BP,xu178 10DAP,ye479BP 和 ye478 10DAP 中,它们分别有 16,056,493;14,624,016;14,472,955和17,176,565个读数与玉米基因组完全匹配,分别占总reads 的 76.2%;67.92%;74.68%和 68.02%。（2）鉴定了许178和掖478中的已知miRNAs。在许178中共鉴定到16个玉米miRNA家族的44个已知miRNA,在掖478中共检测到12个玉米miRNA家族的33个miRNA出现差异表达。其中,许178授粉后的幼穗中22个miRNA成员显著上调表达,22个成员显著下调表达;掖478授粉后的幼穗中25个成员显著上调表达,8个成员显著下调表达;在许178和掖478两个品种中共鉴定的已知miRNA中,16个成员在许178和掖478中显著上调表达,4个成员在许178和掖478中显著下调表达,另外有2个成员在许178中下调表达,而在掖478中上调表达。（3）鉴定了许178和掖478中的新miRNAs。共鉴定到32个新的授粉后发育相关miRNA,分别以miRn和miRy命名。32个新的miRNA中,许178中显著差异表达的有18个,16个上调表达,2个下调表达;掖478中显著差异表达的有14个,8个上调表达,6个下调表达;有4个新鉴定的miRNA在许178和掖478中均上调表达,1个在许178和掖478中均下调表达,此外有1个miRNA在许178中上调表达,而在掖478中下调表达。（4）通过软件预测了 zma-miRx2 的靶基因为 GRMZM2G461230,zma-miRy23的靶基因为 GRMZM2G129288,zma-miRy28 的靶基因为 GRMZM2G418749。利用5’race 方法验证了 zma-miRx2 对其靶基因 GRMZM2G461230、zma-miRy23 对其靶基因GRMZM2G12928介导的mRNA的剪切位点。荧光定量PCR结果显示,zma-miRx2 与其靶基因 GRMZM2G461230、zma-miRy28 与其靶基因GRMZM2G418749的表达丰度成反比关系,结果表明miRNA对其靶基因mRNA表达的负调控可能是玉米幼穗授粉后发育调节的生理基础之一。

关键词：玉米 miRNA 小RNA测序 5’race 荧光定量PCR