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LPL基因的增强子鉴定及其在脂肪沉积中的功能研究

LPL基因的增强子鉴定及其在脂肪沉积中的功能研究

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作者：李雪旻四川农业大学

学位级别：硕士

脂肪组织是能量储存的主要来源,对全身代谢稳态等方面有重要影响,其主要通过甘油三酯的合成和分解维持动物体内的能量平衡。作为一种脂肪分解复合酶,脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)对甘油三酯代谢和运输发挥重要作用。在农业动物... 详细信息

脂肪组织是能量储存的主要来源,对全身代谢稳态等方面有重要影响,其主要通过甘油三酯的合成和分解维持动物体内的能量平衡。作为一种脂肪分解复合酶,脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)对甘油三酯代谢和运输发挥重要作用。在农业动物中,LPL与猪、羊等家畜动物的背膘厚、肉质等重要经济性状显著关联。因此,鉴定LPL的重要调控元件将为猪分子育种提供新的潜在靶点。本实验利用环状染色质构象捕获技术(circular chromosome conformation capture sequencing,4c-seq)绘制了LPL基因在前体脂肪细胞成脂分化前后的互作图谱,结合染色质免疫共沉淀技术(chromatin Immunoprecipitation,ch IP-seq)在与脂蛋白酯酶LPL基因启动子互作的200 kb的基因间区鉴定了8个候选增强子。鉴定了LPL基因的2个活性增强子LPL-E1与LPL-E2,揭示了过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor,gamma,PPARG)和类维生素A受体(αretinoid X receptor,alpha,RXRA)分别对LPL-E1与LPL-E2活性的重要影响。主要结果如下:(1)利用4c-seq技术构建了LPL基因在3T3-L1成脂分化前后的基因三维染色质互作图谱,4c-seq文库技术性重复之间的Pearson相关系数大于0.4。分化前文库中共鉴定51个互作位点,分化后文库中共鉴定17个互作位点。(2)相较于分化前文库,分化后文库展现出更高的trans互作比例(分化前:58.4%;分化后:62.55%)。使用DEseq2软件比较了LPL基因互作位点在成脂分化前后的差异,相较于分化前样本,分化后样本显著上调的互作位点34个,显著下调的互作位点2,280个,表明LPL基因互作在分化前后具有显著变化。(3)结合3T3-L1分化后的组蛋白H3K4me1和H3K27me3的ch IP-seq数据,鉴定出LPL基因的8个潜在活性增强子(LPL-E1～E8)位于200 kb的基因间区域(chr8:68,840,513–69,040,028),该区域显示出H3K27ac组蛋白的显著富集。利用双荧光素酶报告系统评估了8个潜在增强子的活性,与对照载体相比,LPL-E1与LPL-E2两个增强子显著增加荧光素酶活性。其中,LPL-E1增强1.74倍(P4)为了明确LPL基因增强子活性改变影响脂肪前体细胞成脂分化能力的影响,本研究设置了三个组别(cRISPRi-E1,cRISPRi-E2和cRISPRi-control)。成脂分化后7天的结果表明,与对照组相比,3T3-L1细胞中LPL基因的表达显著降低(Pseq结果表明,cRISPRi-E1和cRISPRi-E2相较于cRISPRi-control下调的基因主要富集在单羧酸代谢过程,脂肪酸代谢过程,脂肪细胞分化,中性脂代谢过程以及甘油三酯代谢过程等功能条目中。(5)通过转录因子(Transcription factor,TF)motif富集分析发现,LPL-E1和LPL-E2增强子展现出PPARG和RXRA的motif显著富集,结合公开ch IP-seq(PPARG、RXRA)数据集,结果显示PPARG和RXRA在LPL-E1和LPL-E2增强子区域显著富集。将构建的LPL-E1和LPL-E2双荧光素酶报告载体、PPARG和RXRA过表达载体与p RL-TK质粒共转染到H293T细胞中测定荧光素酶活性,荧光素酶报告上实验结果显示,PPARG和RXRA过表达能显著增加LPL-E1和LPL-E2双荧光载体在后荧光素酶活性。本研究绘制了LPL基因在成脂分化前后的高分辨率全基因组互作图谱;鉴定并评估了LPL基因增强子的转录活性;明确了LPL-E1和LPL-E2在成脂分化中的功能;解析了两个重要成脂转录因子(PPARG和RXRA)对LPL-E1、LPL-E2活性的调控作用。综上,本研究为明确染色质互作对成脂分化基因的转录调控作用提供了理论参考。

关键词： LPL基因染色质互作 4c-seq 增强子转录因子

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