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Lactobacillus fermentum 4,6-α-葡萄糖基转移酶的克隆表达、酶学性质及应用研究

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Lactobacillus fermentum 4,6-α-葡萄糖基转移酶的克隆表达、酶...

作者：盛露菲江南大学

学位级别：硕士

麦芽糊精作为淀粉的衍生物常被应用于食品、保健品、医药生产等领域,而用酶法以麦芽糊精为底物制备的改性麦芽糊精能使其原有的物化性质得到改善,同时还可降低麦芽糊精原有的热量,是一种更具有应用前景的膳食纤维。4,6-α-葡萄糖基转移... 详细信息

麦芽糊精作为淀粉的衍生物常被应用于食品、保健品、医药生产等领域,而用酶法以麦芽糊精为底物制备的改性麦芽糊精能使其原有的物化性质得到改善,同时还可降低麦芽糊精原有的热量,是一种更具有应用前景的膳食纤维。4,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-GTases)作为近些年刚被发现的一类酶,具有切割α(1-4)键转苷形成α(1-6)键的功能,因此这类酶在改性麦芽糊精的制备中具有较大的应用潜力。本论文主要研究结果如下:(1)4,6-α-GTases基因的筛选及截短表达。根据已报道的4,6-α-GTases的保守基序设计简并引物并以筛选得到的乳酸菌的基因组为模板进行PCR,结合数据库信息,成功筛选到一个假定的4,6-α-葡萄糖基转移酶基因(gtf16)。该全长基因在*** BL21(DE3)中不表达,通过不同的截短方式对目的基因(gtf16)进行截短,目的蛋白截短后的最高酶活为83.7U·m L,最适pH为5.0,最适温度为40℃,在40℃下的半衰期为30 min;该酶可以利用麦芽三糖及更大聚合度的麦芽寡糖作为供体底物;其与直链淀粉制备的α-葡聚糖产物是由连续α(1-4)键连接的还原端部分和连续α(1-6)键连接的非还原端部分组成(Ⅰ型),其中α(1-6)键比例可达75.0%。(2)重组4,6-α-GTase在改性麦芽糊精制备中的应用。根据消化酶水解后产物中抗消化成分(RS)的含量对其制备工艺进行优化,确定反应的最佳条件为:温度45℃,pH 4.5,加酶量2000 U·g底物,反应时间6 h。此条件制备的改性麦芽糊精中,RDS含量为22.1%,SDS含量为4.9%,RS含量为73.0%。(3)改性麦芽糊精的体外益生效益探究。添加改性麦芽糊精的培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.5-0.9(OD),pH从7.0下降至4.5-5.3;添加葡萄糖的培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.3-1.1(OD),pH从7.0下降至4.0-5.5;基础培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.04-0.16(OD),pH从7.0下降至6.4-6.7;相较而言,益生菌可以将改性麦芽糊精作为碳源物质利用并可进一步合成短链脂肪酸。(4)改性麦芽糊精对面粉加工品质的影响。从粉质及淀粉糊化两个方面进行分析,改性麦芽糊精的添加会增强面粉的筋力和延缓淀粉的回生。添加7%改性麦芽糊精的高筋面粉,稳定时间从22.6 min延长至29.5 min,弱化度从31.0 Fu降至8.0 Fu,淀粉回生值下降约25.6%;添加5%改性麦芽糊精的中筋面粉,稳定时间从8.9 min延长至11.7 min,弱化度从103.0 Fu降至41.0 Fu,淀粉回生值下降约28.1%。(5)改性麦芽糊精对面包和馒头等面制品品质的影响。添加3%改性麦芽糊精的面包在第一天硬度比对照组低81.7%,常温储存7 d,硬度比对照低22.1%;添加7%改性麦芽糊精的馒头,第一天硬度比对照低53.2%,在4℃冷藏7 d,硬度比对照低54.1%。

关键词： 4,6-α-葡萄糖基转移酶截短表达酶学性质改性麦芽糊精

4,6-α-葡萄糖基转移酶和环糊精水解酶协同制备异麦芽/麦芽聚糖的机制研究

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4,6-α-葡萄糖基转移酶和环糊精水解酶协同制备异麦芽/麦芽聚糖的...

作者：刘奕希江南大学

学位级别：硕士

异麦芽/麦芽聚糖(Isomalto/malto-polysaccharides,IMMP)是一种新型α-葡聚糖,具有作为可溶性膳食纤维的潜力。来自罗伊氏乳杆菌121(Limosilactobacillus reuteri 121)的4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B-ΔN,能够以麦芽七糖(Maltoheptaose,G7)为底物,合成线性非分支型IMMP。但产物中聚合度大于10的化合物含量非常低,且生产成本高昂。目前,Gtf B-ΔN转糖基作用的供受体关系已被较好研究,但底物中的小分子受体及酶的催化活性对IMMP分子结构的调控机制尚不清晰。因此,本课题利用来自太平洋嗜热古生菌(Palaeococcus pacificus)的环糊精水解酶Pp CD,特异性水解β-环糊精(β-Cyclodextrin,β-CD)生成G7,与*** 121 Gtf B-ΔN协同制备IMMP。通过比较不同的合成途径,探究了双酶策略对IMMP精细结构的影响,并基于双酶协同作用机制,探究了底物组成和Gtf B-ΔN催化活性对IMMP分子结构的调控机制。主要研究内容及结果如下:(1)酶的表达及IMMP合成条件确定。首先以大肠杆菌BL21(DE3)*为宿主异源表达了来自*** 121的4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B-ΔN和来自***的环糊精水解酶Pp CD。进一步研究了双酶添加量比例、反应温度和反应时间对β-CD消耗率和IMMP产率的影响,确定了双酶协同制备IMMP的反应条件:Pp CD加酶量为0.6 U/m L,Gtf B-ΔN加酶量为0.2 U/m L,反应温度40℃,反应时间72 h。IMMP的最高产率为16.19%,β-CD的消耗率达91.72%。顺序处理在最佳的双酶添加量比例和反应时间下进行,Pp CD在75℃初步反应100 min,随后加入Gtf B-ΔN在40℃继续反应至72 h。此时β-CD的消耗率达86.27%,IMMP产率为14.82%。(2)双酶协同制备IMMP的合成途径及产物结构研究。通过分析体系中的产物组成,同步处理相比顺序处理能够更好地避免Pp CD对麦芽低聚糖的水解副反应。将同步处理和顺序处理制备的IMMP分别命名为IMMP-Sim和IMMP-Seq,其重均分子量分别为3.266 k Da和4.052 k Da,平均聚合度(Degree of polymerization,DP)分别为21和23,α1→6糖苷键含量分别为67%和72%。与单独使用Gtf B-ΔN作用G7的产物相比,双酶协同制备的IMMP显著提高了产物中α1→6糖苷键的比例。(3)双酶协同制备IMMP的机制研究。通过酶指纹图谱表征IMMP的精细结构为α1→4链段镶嵌在还原性末端和中间部分,较长的α1→6链段镶嵌在非还原性末端和中间部分。通过分析IMMP中各链段的占比,结果表明IMMP-Sim和IMMP-Seq呈现出两种完全不同的键型分布。在同步处理中,Gtf B-ΔN倾向于在反应初期抓取较长的受体底物,而G7的持续释放促进了IMMP-Sim非还原性末端α1→6链的延长,占比达56.76%。在顺序反应中,G7的积累伴随着小分子麦芽低聚糖的增加,这有助于Gtf B-ΔN转糖基活性的效率,并潜在影响了Gtf B-ΔN的水解活力,导致IMMP-Seq具有更多的α1→6链段和α1→4链段镶嵌在中间部分,分别占36.22%和9.6%。(4)IMMP分子结构的调控研究。通过控制Pp CD的水解程度,调节了G7的释放速度以及小分子麦芽低聚糖的组成,制备了平均DP 12.9～29.5的IMMP,实现了IMMP中间α1→4链段在主链上的“滑动”。通过添加特定的麦芽低聚糖受体,靶向合成了具有低分散性的IMMP,且受体底物的长度一定程度上决定了还原性末端α1→4链段的占比。此外,通过使用本实验室的前期研究中构建的四种Gtf B-ΔN突变体,在双酶体系中制备了平均DP 16.3～23.6的IMMP。其中,位于受体亚位点+2附近氨基酸H1056的突变导致酶活性和底物亲和力显著降低,产生了低DP的IMMP。而位于受体进入通道附近氨基酸Q1126的突变,有利于空间位阻的去除,获得了具有较长非还原性末端α1→6链段的IMMP。

关键词： 4,6-α-葡萄糖基转移酶环糊精水解酶异麦芽/麦芽聚糖分子结构

Lactobacillus reuteri 1214,6-α-葡萄糖基转移酶GtfBdN改性薯类淀粉产物结构及理化特性研究

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食品与发酵工业 2021年第9期47卷 42-48页

作者：蒋彤纪杭燕柏玉香食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 江南大学食品学院江苏无锡214122 江南大学食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122 食品安全国际联合实验室(江南大学) 江苏无锡214122

经过Lactobacillus reuteri 1214,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-glucanotransferase,4,6-α-GTase)GtfB改性淀粉可以得到一种具有益生潜力的水溶性膳食纤维。利用截断N端但高表达的全活性GtfBdN改性薯类淀粉,包括红薯淀粉、木薯淀粉和马... 详细信息

经过Lactobacillus reuteri 1214,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-glucanotransferase,4,6-α-GTase)GtfB改性淀粉可以得到一种具有益生潜力的水溶性膳食纤维。利用截断N端但高表达的全活性GtfBdN改性薯类淀粉,包括红薯淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉,对产物进行结构和性质测定。通过核磁共振光谱、高效尺寸排阻色谱和高效阴离子交换色谱分析表明,GtfBdN改性分别使红薯淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉中(α1→6)键比例提升至20.7%、19.5%和26.6%;产物相对分子质量减小,分子质量分布变广;聚合度>24的链段比例降低,聚合度6~12的链段比例大大增加。采用快速黏度分析仪、流变仪和差示扫描量热仪等测试发现,产物黏度大幅下降,表现出更多的流体行为,短期回生和长期回生减慢。该研究为4,6-α-GTase改性薯类淀粉在食品体系中的应用提供了理论和应用依据。

关键词： 4,6-α-葡萄糖基转移酶薯类淀粉结构分析糊化特性黏弹特性回生特性

基于右旋糖酐合成与降解的两步法制备低聚异麦芽糖

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食品与发酵工业 2021年第16期47卷 135-140,146页

作者：易子玲吴敬陈晟王蕾食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

低聚异麦芽糖(isomalto-oligosacchrides,IMOs)是一类由α-1,6糖苷键连接的寡聚糖,主要成分是异麦芽糖、异麦芽三糖(isomaltotriose,IG3)和潘糖等,因其具有可提高免疫力、预防龋齿等益生性能被广泛研究和应用。研究表明IMOs中可促进双... 详细信息

低聚异麦芽糖(isomalto-oligosacchrides,IMOs)是一类由α-1,6糖苷键连接的寡聚糖,主要成分是异麦芽糖、异麦芽三糖(isomaltotriose,IG3)和潘糖等,因其具有可提高免疫力、预防龋齿等益生性能被广泛研究和应用。研究表明IMOs中可促进双歧杆菌的增殖主要归因于IG3。由于传统制备工艺产率低且产品中益生成分含量低,高效生产IMOs仍存在瓶颈。该研究提出使用来源于Lactobacillus fermentum的4,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-glycosyltransferases,LfGT)合成右旋糖酐,再使用来源于Brevibacterium fuscum的异麦芽三糖右旋糖酐酶(isomaltotrio-dextranase,BfIMTD)降解右旋糖酐的两步法制备IMOs的工艺,由此提高IMOs产率和IG3比例。在37℃,pH 6.0,反应时长为24 h的条件下,使用LfGT与普鲁兰酶和异普鲁兰酶复配可将200 g/L DE2麦芽糊精转化为产物占比为66.3%的右旋糖酐,其α-1,6糖苷键比率可达99.3%;在40℃,pH 7.5,反应10 h的条件下,BfIMTD水解右旋糖酐(终质量浓度100 g/L)可产出98.3 g/L的IG3,两步法IG3最终产率为65.2%。此两步法工艺为制备IMOs提供新思路,为IMOs链长可控性提供新策略。

关键词：低聚异麦芽糖异麦芽三糖右旋糖酐异麦芽三糖右旋糖酐酶 4,6-α-葡萄糖基转移酶普鲁兰酶异普鲁兰酶

改性麦芽糊精的酶法制备及其在烘焙制品中的应用

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食品与发酵工业 2021年第16期47卷 147-151页

作者：李娜陈晟吴敬食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

该研究旨在酶法制备一种改性麦芽糊精,其能应用于面包制作中并有效改善面包品质。选用分支酶与4,6-α-葡萄糖基转移酶复配并优化酶反应条件制备改性麦芽糊精,将得到的产物以不同比例添加到面包制作中,研究其对面包品质的影响。结果表明... 详细信息

该研究旨在酶法制备一种改性麦芽糊精,其能应用于面包制作中并有效改善面包品质。选用分支酶与4,6-α-葡萄糖基转移酶复配并优化酶反应条件制备改性麦芽糊精,将得到的产物以不同比例添加到面包制作中,研究其对面包品质的影响。结果表明,将能特异性转移DP6~10麦芽寡糖形成支链的分支酶(CyBE),与能转移单个葡萄糖生成连续α-1,6-糖苷键连接的异麦芽多糖的4,6-α-葡萄糖基转移酶(GTF13),复配得到的改性麦芽糊精,以添加量5%(质量分数)加入面包制作中,能使面包硬度降低71.01%,长期贮存中明显延缓面包老化;同时提高了面包的抗氧化自由基能力,其中对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的清除率分别提高了2、8、4倍。该研究结果为酶法改性的麦芽糊精应用于面包品质的改良提供了一种新的技术思路。

关键词：分支酶 4,6-α-葡萄糖基转移酶麦芽糊精面包改良老化

基于4,6-α-GTase转化直链糊精的异麦芽大糖的合成机制及应用研究

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基于4,6-α-GTase转化直链糊精的异麦芽大糖的合成机制及应用研究

作者：薛乃祥江南大学

学位级别：硕士

异麦芽聚糖是主要通过α1→6键连接多个葡萄糖残基形成的α-葡聚糖,其中聚合度在11～100之间的异麦芽聚糖被命名为异麦芽大糖(isomaltomegalosaccharides,IMMs),IMMs具有独特的增溶、抗炎和免疫调节功能,具有较好的应用潜力。目前,IMMs... 详细信息

异麦芽聚糖是主要通过α1→6键连接多个葡萄糖残基形成的α-葡聚糖,其中聚合度在11～100之间的异麦芽聚糖被命名为异麦芽大糖(isomaltomegalosaccharides,IMMs),IMMs具有独特的增溶、抗炎和免疫调节功能,具有较好的应用潜力。目前,IMMs由右旋糖酐糊精酶催化麦芽糖六糖和麦芽七糖制备,该方法底物价格高昂,且已经被专利保护。此外,该方法只能获得平均聚合度为11的IMMs,增溶效果较弱。因此,需要新的方法来完成更高相对分子量IMMs的合成。针对该问题,本研究以来自Limosilactobacillus reuteri 121的4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B-ΔN催化直链糊精制备了IMMs,并对酶学特性和IMMs增溶特性进行了探究。首先以大肠杆菌BL21(DE3)*对Gtf B-ΔN进行了异源表达,以镍亲和层析柱对Gtf B-ΔN进行纯化,SDS-PAGE显示Gtf B-ΔN酶液已达到电泳纯,分子量约为100 k Da,酶活为5.23 U/mg。适用于Gtf B-ΔN催化的温度和p H分别为40℃和5.0。根据底物和产物分子量的对应关系,从合成的多种直链糊精中筛选出了合适的IMMs制备底物。HPGPC-RID和HPAEC-PAD显示淀粉蔗糖酶产物、脱支蜡质玉米淀粉和上清糊精的相对分子量和链长分布存在明显差异,低温回生是一种能够获得更低相对分子量直链糊精的有效方法。Gtf B-ΔN催化上清糊精产物的重均分子量和α1→6键含量分别为1.23×10 g/mol(聚合度76)和83.8%,上清糊精(2.1×10 g/mol)是制备IMMs的合适底物。对呈现出双峰分布的产物中的寡糖和IMMs组分的性质和结构进行了鉴定。寡糖和IMMs组分的α1→6键含量分别为34.6%和88.6%。HPAEC-PAD表明寡糖的主要组分为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖,同时还存在少量的异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖。IMMs分别被五种酶水解前后的相对分子量分布和产物组成表明,IMMs为有α1→4片段镶嵌在非还原性末端、还原性末端和中间部分的长α1→6链结构,α1→4片段聚合度分别为2～5、2～4和2～6。不同反应时间时Gtf B-ΔN产物的相对分子量分布、链长分布和酶活表明,反应初期Gtf B-ΔN主要发挥水解作用,产生寡糖致使相对转糖基活性增加,从而实现了水解和转糖基作用的动态平衡,且转糖基作用优先催化长α1→4链。通过控制上清糊精中麦芽糖添加量,合成了多种IMMs(3.6×10～1.23×10g/mol),测定了其对乙基红的增溶效果和增溶机制。IMMs(1.23×10g/mol)可使乙基红溶解度提高至4.5倍,增溶效果和相对分子量呈现出正相关。1H NMR测定的乙基红质子化学位移表明,IMMs的增溶作用是通过疏水相互作用实现的。傅里叶红外光谱和扫描电镜分别显示出乙基红特征峰的偏移、消失和颗粒形态的成糊变化,这证实了IMMs-乙基红复合物的形成和氢键贡献了增溶效果的可能性。

关键词： 4,6-α-葡萄糖基转移酶直链糊精异麦芽大糖增溶

改性麦芽糊精的酶法制备及其在烘焙食品中的应用研究

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改性麦芽糊精的酶法制备及其在烘焙食品中的应用研究

作者：李娜江南大学

学位级别：硕士

麦芽糊精是淀粉水解的中间产物,在食品烘焙领域具有广泛的应用。麦芽糊精经生物酶处理后,其键型比例、产物分支度、分子量分布等性质会发生改变,得到的改性麦芽糊精产物具有更加良好的应用效果。本文研究了一种酶法制备改性麦芽糊精的方... 详细信息

麦芽糊精是淀粉水解的中间产物,在食品烘焙领域具有广泛的应用。麦芽糊精经生物酶处理后,其键型比例、产物分支度、分子量分布等性质会发生改变,得到的改性麦芽糊精产物具有更加良好的应用效果。本文研究了一种酶法制备改性麦芽糊精的方法,将Cyanothece *** 51142来源的分支酶CyBE特异性转移葡萄糖聚合度(DP)6-10的麦芽寡糖的性质,与4,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-GTs)转移单个葡萄糖生成连续α-1,6-糖苷键连接的异麦芽多糖性质相结合,双酶复配以制备分支链长特异性强、分支度高、分支密集的改性麦芽糊精。本文的主要研究内容如下:(1)CyBE的重组表达及酶学定性。在*** BL21(DE3)中重组表达了CyBE,测定其对直链淀粉和支链淀粉的酶活分别为2342.93 U·mL-1和1079.89 U·mL-1。研究了重组CyBE的相关酶学性质,结果表明,CyBE的最适温度为30℃,最适pH为7.0,30℃下半衰期为27h。(2)改性麦芽糊精的制备及理化性质分析。4,6-α-GTs能催化转苷反应发生,以增加产物分支度,本研究使用的两种4,6-α-GTs分别为Lactobacillus fermentum GTF13和Bacillus sporothermodurans GTF5,均为本实验室前期保藏所得。将CyBE和4,6-α-GTs复配反应制备改性麦芽糊精,研究了不同加酶顺序对改性麦芽糊精理化性质的影响。结果表明,当麦芽糊精先经GTF13处理24 h再经CyBE处理24 h后,会产生具有益生效应的膳食纤维,其含量高达43.57%,分析了该改性麦芽糊精的体外消化性能,发现其抗消化成分由12.01%提高到59.44%。(3)改性麦芽糊精对面包品质的影响。将改性麦芽糊精加入到普通小麦淀粉中来制作面包,当加量范围在3%-10%内时可显著降低面包硬度,其中添加量为5%的使用感最好且面包硬度降低明显,面包硬度值可由对照组的2208.53 g降至640.15 g,仅为对照组硬度的28.98%,同时,将面包在4℃贮藏21天后,对照组的硬度值为4257.57 g,而添加了改性麦芽糊精的实验组面包硬度为1254.48 g,为对照组硬度的29.46%。(4)CyBE链长转移机理的探究。为精准制备一种具有专一分支链长的改性麦芽糊精,以提高其在面包改良方面的应用效果,研究了CyBE的链长转移机理。设计了△W285、△S283-G287、F323A、E204W和S374W五个突变体,其链长转移结果显示,相比于野生型CyBE,△W285和△S283-G287突变体对DP8以上糖链的转移能力变强,F323A对DP7以上糖链的转移能力变弱,E204W和S374W对DP9以上糖链的转移能力变弱。

关键词：分支酶 4,6-α-葡萄糖基转移酶麦芽糊精面包链长