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Brd4通过募集P-tEFb调控3T3-L1细胞分化

Brd4通过募集P-TEFb调控3T3-L1细胞分化

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作者：赵巧宣厦门大学

学位级别：硕士

Brd4是溴结构域BEt蛋白家族中的一员,含有两个N端溴结构域,可以特异性结合乙酰化的组蛋白,作为支架结构募集转录因子、染色质重塑因子、去甲基化酶等调控基因转录,Brd4还参与细胞周期的调控及超级增强子的形成等。此外,Brd4最重要的功... 详细信息

Brd4是溴结构域BEt蛋白家族中的一员,含有两个N端溴结构域,可以特异性结合乙酰化的组蛋白,作为支架结构募集转录因子、染色质重塑因子、去甲基化酶等调控基因转录,Brd4还参与细胞周期的调控及超级增强子的形成等。此外,Brd4最重要的功能是与正性转录延伸因子P-tEFb形成Brd4/P-tEFb复合物,调控基因的转录延伸。正性转录延伸因子P-tEFb由催化亚基CDK9和调节亚基Cyclint组成,是一个具有激酶活性的异源二聚体,P-tEFb可以通过其磷酸化功能解除转录暂停,起到转录延伸暂停释放（pausing release）作用,从而使转录过程顺利完成,调控细胞内约70%的基因转录,是全局性的转录延伸因子。本实验室前期初探及相关文献报道,Brd4蛋白在脂肪细胞分化中有一定的影响,但是具体机制还不太清楚。3t3-l1前脂肪细胞是体外分化常用的经典模型,可以用来研究脂肪细胞的分化如:细胞形态变化、脂滴形成情况、分化相关基因及转录因子的表达等,探索出脂肪细胞分化原理,从而治疗脂肪细胞过度分化引起的肥胖,肥胖性疾病等。脂肪细胞分化本质是基因的选择性表达,由基因转录与表观遗传共同完成。目前研究3T3-L1细胞分化主要集中在表观遗传调控层面,而本文以基因转录延伸过程中的转录暂停释放pausing release作为切入点,对脂肪细胞分化进行初步探索。我们使用经典分化模型3t3-l1细胞,采用“鸡尾酒”法诱导其分化,探索两种转录延伸因子Brd4及P-tEFb对3T3-L1细胞分化的影响。本研究通过基因敲除,药物处理、油红染色、qRt-PCR、免疫共沉淀等技术和方法,发现:（1）转录因子Brd4促进3T3-L1细胞分化;（2）正性转录延伸因子P-tEFb促进3T3-L1细胞分化;（3）Brd4通过募集P-tEFb影响3T3-L1细胞分化,上述研究结果从pausing release层面揭示了 Brd4及P-tEFb两种转录延伸因子对脂肪细胞分化的影响,初步建立了转录延伸暂停释放在分化过程中的生物学意义,为今后研发药物治疗肥胖及肥胖相关疾病提供更多理论基础。

关键词： Brd4 P-tEFb 3T3-L1细胞分化

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Il-38在高脂饮食诱导小鼠肥胖中的作用及机制研究

IL-38在高脂饮食诱导小鼠肥胖中的作用及机制研究

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作者：孙俊宁波大学

学位级别：硕士

目的肥胖症是一种慢性疾病,容易引起脂肪肝、高血压、Ⅱ型糖尿病等疾病,并常常伴随着炎症反应的产生。白细胞介素(interleukin,Il)-38是Il-1家族的成员之一,目前研究发现Il-38在关节型银屑病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中能够抑... 详细信息

目的肥胖症是一种慢性疾病,容易引起脂肪肝、高血压、Ⅱ型糖尿病等疾病,并常常伴随着炎症反应的产生。白细胞介素(interleukin,Il)-38是Il-1家族的成员之一,目前研究发现Il-38在关节型银屑病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中能够抑制炎症细胞因子的表达。本研究拟克隆小鼠Il-38基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1-mIl-38,通过3t3-l1细胞和高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,从细胞和动物水平探讨Il-38对肥胖症的影响及作用机制。方法1.从脾脏中提取小鼠总RNA,Rt-PCR技术扩增Il-38全长编码区片段,用限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ将PCR产物和pcDNA3.1-Il-35载体双酶切,酶切产物用t4 DNA连接酶连接并转化到感受态细胞DH5α中,构建mIl-38的真核表达载体pcDNA3.1-mIl-38。2.高脂饲料喂养ICR小鼠构建高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,流体力学注射pcDNA3.1-mIl-38质粒,16周后将小鼠处死,收集小鼠组织样本。小鼠脂肪组织和肝脏中脂滴的大小和数量通过HE染色和油红O染色检测;进行腹腔注射糖耐量实验和胰岛素耐量实验检测小鼠葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的变化;qRt-PCR检测脂肪组织中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,tNF)-α、Il-6、Il-1β、CD68、F4/80、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1表达量的变化;血清中Il-6、Il-1β、MCP-1等含量的变化用ElISA检测。3.诱导分化3t3-l1前脂肪细胞,在诱导培养基中加入重组Il-38蛋白。油红O染色检测细胞中脂滴形态和大小的变化;qRt-PCR检测细胞中GAtA-3、GlUt4、PPARγ2、Il-6、Il-1β、MCP-1表达量的变化;细胞培养液中Il-6、Il-1β、MCP-1含量的变化用ElISA检测。结果1.提取小鼠总RNA,Rt-PCR扩增出小鼠Il-38全长序列,成功构建真核表达载体pcDNA3.1-mIl-38。2.成功构建肥胖小鼠模型。肥胖模型组小鼠体重与对照组相比明显增加,Il-38处理后的实验组小鼠与对照组无明显区别;模型组小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性降低,实验组增加了葡萄糖耐受和胰岛素敏感;与模型组相比,Il-38组降低了脂肪组织中tNF-α、Il-6、Il-1β、CD68、F4/80、MCP-1的表达和血清中Il-6、Il-1β、MCP-1的含量。3.诱导3T3-L1细胞分化时,Il-38干预后,细胞中脂滴明显减少;细胞中GAtA-3、GlUt4和Il-1β的表达升高,Il-6、MCP-1的表达降低;培养液中Il-6、MCP-1、Il-1β的含量降低。结论成功构建了小鼠Il-38真核表达载体,利用流体力学注射使Il-38在小鼠体内过表达,通过高脂饮食诱导肥胖小鼠模型研究Il-38在肥胖症中的作用,发现Il-38能有效减缓高脂饮食诱导的肥胖,能抑制小鼠炎症细胞因子表达和增加其葡萄糖耐受和胰岛素敏感;用Il-38处理3t3-l1细胞,发现它能抑制3T3-L1细胞分化和炎症细胞因子表达。

关键词：白细胞介素-38 流体力学注射高脂饮食诱导肥胖 3T3-L1细胞分化

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