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褪黑素联合神经干细胞3d移植促进大鼠颅脑损伤的修复

褪黑素联合神经干细胞3D移植促进大鼠颅脑损伤的修复

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作者：方煊宇西南大学

学位级别：硕士

颅脑损伤作为当代战创伤中最常见的损伤形式,发生率高达20%以上,死残率为各种损伤之首,时至今日及时有效的治疗措施仍然有限。目前广泛应用的颅脑损伤急性期手术救治方案虽显著提高了病员生存率,但留下的偏瘫、认知等神经功能障碍仍是... 详细信息

颅脑损伤作为当代战创伤中最常见的损伤形式,发生率高达20%以上,死残率为各种损伤之首,时至今日及时有效的治疗措施仍然有限。目前广泛应用的颅脑损伤急性期手术救治方案虽显著提高了病员生存率,但留下的偏瘫、认知等神经功能障碍仍是影响幸存伤员生活质量的核心问题。因此寻找促进颅脑损伤修复的策略和方法是当前该领域的研究前沿。神经干细胞是在多种动物的脑组织中发现的一类具有自我更新能力,可分化成神经元、胶质细胞、少突胶质细胞等的多潜能干细胞[1,2]。正常状态下,神经干细胞在成年动物中存量少并处于静息状态。现代研究表明病损条件下,神经干细胞可以被激活并参与病灶区的神经修复,所以在颅脑损伤中,使用神经干细胞作为一种修复治疗手段的可能性受到人们的重视。但内源性神经干细胞因其数量少,目前应用受到限制,而外源性神经干细胞的移植可能是突破这一难题的方法。无论是内源性还是外源性神经干细胞,其分化为功能性神经元的数量比例较低,难以达到神经修复的需求,因此促进神经干细胞向功能性神经元的分化成为研究的热点。褪黑素是在正常的昼夜节律调控影响下在夜间由松果体分泌的一种激素,血浆,唾液,尿液中都可以检测到褪黑素或者其代谢产物[3-7]。褪黑素可以通过调控细胞内的离子通道(如钙离子通道),影响分子信号通路(如Notch、MAPK等)[8-10],通过调节线粒体呼吸等途径精准调控细胞的生理活动与生命周期。在神经系统中,已经有研究表明褪黑素具有抗氧化应激、抗缺氧、发挥神经保护等功能[11]。少量文献表明,褪黑素可以促进神经干细胞增殖,但对神经干细胞生物学行为及其与神经干细胞联合移植对神经系统损伤的影响,目前研究较少。所以我们将神经干细胞和褪黑素结合,并且通过与Matrix Gel联合形成三维移植填充的方式,探究用于促进颅脑损伤修复的可能性。1.褪黑素对神经干细胞损伤的影响为了研究褪黑素是否对神经干细胞有影响,我们以体外培养的神经干细胞为基础,按0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L浓度梯度添加褪黑素,随后通过形态观察、CCK8等方法确定细胞增殖能力。首先,通过免疫荧光鉴定神经干细胞(抗体),并且明确其具有向星形胶质细胞(GFAP)、神经元(Nestin)、少突胶质细胞(Olig2)等神经细胞亚类分化的潜能。在此基础上我们进行褪黑素对神经干细胞影响的实验。通过氯化钴(CoCl2)+EBSS无糖培养基模拟损伤后病灶区的缺氧缺糖条件,研究褪黑素对神经干细胞的影响时,我们发现未处理组神经干细胞存活能力大幅下降,在褪黑素25μmol/L处理后,神经干细胞的存活数量上升,提高其生存能力。这些证据表明褪黑素在缺血缺氧条件下对神经干细胞具有较好的神经保护作用。2.大鼠颅脑损伤模型的制作为研究褪黑素对神经干细胞影响的潜在临床应用价值,我们拟采用颅脑损伤模型进行检测,我们对颅脑损伤模型进行了新的改良设计。在传统的撞击伤颅脑损伤模型的基础上,我们通过开放性手术的方式,在大鼠颅顶打开骨窗,在前囟右1mm,前方1mm的大鼠M1,M2运动皮层进行可控的精确定位损伤,取3×3×3 mm3大小的皮层组织模拟颅脑损伤后的组织缺损,并且留下损伤后病灶空腔,最后将头皮组织缝合,即完成颅脑损伤模型的制作。病灶区空腔相较于传统的撞击模型可以有效模拟颅脑损伤后由于脑组织缺失破坏所造成的结构性损伤影响。模型制作后7天对大鼠进行神经损伤严重程度评分(NSS)。未处理sham组大鼠NSS评分为0分,损伤后的大鼠NSS评分在12-14之间,相较于正常大鼠具有明显的神经功能障碍,组间差异显著。在相同处理条件下,同一批次各实验大鼠之间行为学评分无统计学差异p3d移植修复大鼠颅脑损伤前述研究提示褪黑素25μmol/L对缺氧缺糖条件下的神经干细胞具有保护作用,所以我们将褪黑素与神经干细胞共同培养,并且加入Matrix Gel混合形成3d填充移植到大鼠颅脑损伤模型的病灶区中,观察其对于损伤区域的修复情况。相较于以往的细胞注射填充移植方法,我们将Matrix Gel加入到神经干细胞形成3d移植修复体系,可以有效地对损伤形成的组织空腔起到3d结构支撑的作用,并且提供细胞生长的立体环境。在大鼠损伤模型移植细胞修复后7天,通过小动物MRI磁共振、行为学评分、免疫组化、免疫荧光、激光共聚焦检测等技术手段,从大鼠整体生理功能以及组织内细胞水平对大鼠的神经功能恢复进行评估。免疫组化结果发现在褪黑素与干细胞共移植的实验组中,病灶区周围细胞量明显增加,病灶区边缘形态更完整。免疫荧光结果显示,褪黑素和神经干细胞共移植的损伤大鼠脑组织内,胶质细胞前体细胞明显增多,可以更好的提供结构支持保护与营养功能,促进病灶区细胞的存活以及神经功能修复。行为学评分显示,NSC液体移植组

关键词：褪黑素神经干细胞颅脑损伤神经功能恢复 3d移植

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