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肠道病毒71型3c蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究

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病毒学报 2012年第3期28卷 195-200页

作者：陈丽杨志建周正蔡威特滕新泽张高峡上海泽润生物科技有限公司疫苗研发中心上海201203

本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3c蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究。首先,将3c蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3c蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标... 详细信息

本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3c蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究。首先,将3c蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3c蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3c蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究。经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a-3c构建正确,表达的重组3c蛋白酶相对分子质量约22kD;纯化后有无His标签的3c蛋白酶均能催化荧光底物3B-3c,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3c蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、***-1、0.0669 Min-1;其最适反应pH为7.0,最佳反应温度为30℃～37℃。本实验成功表达并纯化了重组3c蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3c蛋白酶检测方法的研发奠定了基础。

关键词：肠道病毒71型 3c蛋白酶活性研究载体构建蛋白表达

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3c蛋白酶表达、纯化及其活性抑制的研究

3C蛋白酶表达、纯化及其活性抑制的研究

作者：李敏昆明医学院

学位级别：硕士

3c蛋白酶是催化小RNA病毒前体蛋白中非结构蛋白裂解的关键蛋白酶,具有高度的酶切特异性,其在病毒的生命周期中,起着举足轻重的作用,抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割,阻断病毒复制,是小RNA病毒药物治疗研究的靶点之一。小RN... 详细信息

3c蛋白酶是催化小RNA病毒前体蛋白中非结构蛋白裂解的关键蛋白酶,具有高度的酶切特异性,其在病毒的生命周期中,起着举足轻重的作用,抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割,阻断病毒复制,是小RNA病毒药物治疗研究的靶点之一。小RNA病毒科是已知最小的动物RNA病毒,共有7个属,是引起人类严重疾病的病原体,所以对3c蛋白酶的研究为对这些疾病的预防和治疗提供了科学依据和理论基础。3c蛋白酶的识别位点为Leu Glu Val Leu Phe Gln↓GlyPro,而切割位点在Gln—G1y之间,称为Q—G位点。鉴于此我们构想通过基因工程的方法得到重组3c蛋白酶,利用其切割的特异性在体外验证重组3c蛋白酶的活性,从而为以后开发新型的基因工程工具酶奠定基础,并且通过动物实验得到3c蛋白酶抗体,应用抗体技术抑制3c蛋白酶活性,进而达到抑制小RNA病毒科病毒复制的目的。我们克隆到人鼻病毒14型的3c蛋白酶的基因编码区,将其克隆到表达载体pBV220上。经转化表达宿主菌BL-21,获得阳性克隆,通过温度诱导实现了重组3c蛋白酶在大肠杆菌中的高效、稳定表达,并经纯化获得纯度达90%以上的3c蛋白酶;另一方面,我们表达、纯化了含3c蛋白酶切点的融合蛋白白细胞介素—11,作为3c蛋白酶的靶蛋白,以检测其活性。结果,我们表达的重组3c蛋白酶在体外能够将融合蛋白白细胞介素-11的硫氧还蛋白融合头切下,表明我们得到的3c蛋白酶在体外具有酶活性。随后,我们将得到的3c蛋白酶免疫豚鼠,得到3c蛋白酶抗体,培养Vero细胞,检验应用3c蛋白酶抗体抑制3c蛋白酶活性,以阻断小RNA病毒科病毒复制的效果,初步实验没有得到明显的阳性结果。我们希望通过这次实验探索可以为临床治疗小RNA病毒科病毒引起的多种疾病提供有效的治疗思路。另外,冠状病毒属病毒的3c样蛋白酶和3c蛋白酶在序列和空间构象上具有一定的同源性,对3c蛋白酶活性的研究和探索有助于我们了解和研究3c样蛋白酶,进而为治疗SARS等由冠状病毒引起的疾病提供了科学依据和理论基础。

关键词： 3c蛋白酶表达纯化酶切活性抑制

口蹄疫病毒3c蛋白酶结构及其功能在抗病毒药物中的探讨

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中国生物工程杂志 2008年第S1期28卷 247-250页

作者：刘萍丛国正常惠芸刘学荣牟克斌黄银君卫广森中农威特生物科技股份有限公司兰州7300462 中国农业科学院兰州兽医研究所家禽疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

3c蛋白酶在口蹄疫病毒复制过程中起重要作用,尤其是对多聚蛋白的裂解作用。研究其结构、裂解机制以及切割方式,能更好的了解其在病毒复制中的作用和生物学功能。对阐明口蹄疫病毒3c蛋白酶基于其结构而进行的药物设计有重要现实意义。

关键词：口蹄疫病毒 3c蛋白酶结构和功能裂解机制抗病毒药物

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口蹄疫病毒3c蛋白酶的研究进展

中国人兽共患病学报 2008年第11期24卷 1063-1065,1069页

作者：周建华常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的一种急性、烈性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病。其临床症状表现为口部、蹄部暂时性地出现水疱,并且病畜体质虚弱,生产能力急剧降低。口蹄疫的暴发给当地... 详细信息

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的一种急性、烈性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病。其临床症状表现为口部、蹄部暂时性地出现水疱,并且病畜体质虚弱,生产能力急剧降低。口蹄疫的暴发给当地带来严重的经济损失,疫区乃至整个国家的畜产品出口受到封锁。FMDV属于微RNA病毒科,口蹄疫病毒属,其基因组为正链单股RNA,[第一段]

关键词：口蹄疫病毒 3c蛋白酶 RNA病毒科远距离传播动物疾病症状表现体质虚弱生产能力

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口蹄疫病毒3c蛋白酶的T4噬菌体表面展示

中国兽医科学 2006年第7期36卷 519-522页

作者：田纯见毕英佐曹永长谢青梅华南农业大学动物科学学院广东广州510642

对FMDV 3c基因克隆质粒p3c-T进行PcR扩增,获得了口蹄疫病毒3c蛋白酶基因片段,将此片段与T4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化***,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PcR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了T4噬菌体重组整合... 详细信息

对FMDV 3c基因克隆质粒p3c-T进行PcR扩增,获得了口蹄疫病毒3c蛋白酶基因片段,将此片段与T4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化***,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PcR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了T4噬菌体重组整合质粒pR- 3c。将其转化*** E2后,与SOc基因缺失的噬菌体φT4-Z1同源重组,经溶菌酶依赖性筛选,获得了快速溶菌型噬菌体φT4-3c。经噬菌体PcR扩增、SDS-PAGE分析和Western-bot分析,重组噬菌体可展示约26 ku的重组蛋白;其大小与预期相符,具有免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 3c蛋白酶 T4噬菌体表面展示

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脑炎心肌炎病毒3c蛋白酶抗体的制备和检测

中华实验和临床病毒学杂志 2021年第4期35卷 463-466页

作者：宋芹芹李公启韩俊中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室传染病诊断与治疗创新协作中心北京102206

目的:制备脑炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMcV)的3c蛋白酶抗体并检测抗体特异性反应位点。方法:构建原核表达载体pQE30-3c,将蛋白进行体外原核表达,免疫纯种BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,通过Western blot检测制备的抗体与3... 详细信息

目的:制备脑炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMcV)的3c蛋白酶抗体并检测抗体特异性反应位点。方法:构建原核表达载体pQE30-3c,将蛋白进行体外原核表达,免疫纯种BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,通过Western blot检测制备的抗体与3c蛋白结合的特异性,通过免疫荧光和Western blot检测抗体与EMcV病毒中表达的3c蛋白酶结合的特异性。原核表达具有不同抗原性的EMcV 3c的3个不同片段,并通过Western blot检测单克隆抗体与EMcV 3c蛋白酶不同片段的反应特异性。结果:单克隆抗体与原核表达的3c蛋白酶反应良好,通过Western blot可以检测到病毒中表达的3c蛋白,通过免疫荧光也可以检测到EMcV病毒中的3c蛋白。通过与3c片段的反应发现,单克隆抗体与c端反应,即抗体针对的是c端处的抗原决定簇。结论:成功制备EMcV 3c蛋白酶的抗体,能与原核表达的3c蛋白和病毒3c蛋白反应,且针对的是c端的抗原决定簇。

关键词：脑炎心肌炎病毒 3c蛋白酶单克隆抗体

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小RNA病毒3c蛋白酶及其裂解底物

生物技术通报 2014年第8期30卷 46-51页

作者：刘艳李冰清孟红山东省医学科学院基础医学研究所微生物学研究室济南250000 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院济南250022

小RNA病毒科是一类大的动物病毒科,小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白,3c蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一,3c蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白,利于病毒的复制。3c蛋白酶结构特点、活性中心... 详细信息

小RNA病毒科是一类大的动物病毒科,小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白,3c蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一,3c蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白,利于病毒的复制。3c蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何,裂解的底物功能怎样,是进一步了解3c蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。

关键词：小RNA病毒 3c蛋白酶裂解底物

以柯萨奇B3病毒3c蛋白酶为靶点的体外药物筛选模型的建立及应用

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中国科技论文 2014年第12期9卷 1372-1376页

作者：贺秋红唐延婷李国邦王文明汪颖郭宇天津科技大学生物工程学院天津300457 天津国际生物医药联合研究院天津300457 南开大学药学院天津300071

建立以柯萨奇B组3型病毒3c蛋白酶(cVB3-3c)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现cVB3-3c蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度cVB3-3c蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶... 详细信息

建立以柯萨奇B组3型病毒3c蛋白酶(cVB3-3c)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现cVB3-3c蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度cVB3-3c蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶活性,建立药物筛选模型。对768种化合物进行筛选,获得了2种对cVB3-3c蛋白酶有较强抑制作用的化合物(MDcE-A008和MDcE-A043),Ic50值分别为(60.61±6.26)μmol/L、(105.7±14.88)μmol/L。建立的cVB3-3c蛋白酶药物筛选模型为获得有效抑制剂提供了技术保证。

关键词：柯萨奇B3病毒 3c蛋白酶药物筛选抑制剂

EV71 3c蛋白酶表达纯化、活性分析及与抑制剂模拟对接研究

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中国病原生物学杂志 2017年第8期12卷 722-726页

作者：尧晨光奚彩丽朱祥柳科峰纪梦莹刘媛胡康洪魏艳红湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程湖北省协同创新中心湖北武汉430068

目的表达和纯化肠道病毒71型(EV71)3c蛋白酶并通过与抑制剂相互作用预测其活性位点。方法将3c蛋白酶片段克隆至pET-28a原核表达载体,重组质粒导入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得3c蛋白酶融合蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化后以荧光多... 详细信息

目的表达和纯化肠道病毒71型(EV71)3c蛋白酶并通过与抑制剂相互作用预测其活性位点。方法将3c蛋白酶片段克隆至pET-28a原核表达载体,重组质粒导入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得3c蛋白酶融合蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化后以荧光多肽为底物检测3c蛋白酶的活性。使用AutoDock模拟3c蛋白酶与芦丁(Rutin)和芦平曲韦(Lupintrivir)对接。结果经酶切、PcR、测序证明pET28a-3c重组质粒构建成功,表达产物分子质量约23×10~3,纯化的3c蛋白酶酶活较好;对接结果表明Rutin和Rupintrivir通过形成氢键网和疏水键与3c蛋白酶底物结合位点结合,结合的活性氨基酸残基有His161、Gly163、Gly164、Phe170。结论成功制备了具有生物学活性的高纯度EV71 3c蛋白酶,建立了预测能力较好的对接模型,为以3c蛋白酶为靶点的药物设计和筛选奠定了基础。

关键词：肠道病毒71型(EV71) 3c蛋白酶蛋白纯化酶活检测分子对接