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产朊假丝酵母细胞壁33kd蛋白的酶学特性研究

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常德师范学院学报（自然科学版） 1999年第4期12卷 42-44页

作者：李峰张西平黄昆邹国林常德师范学院生物系常德415000 武汉大学生命科学学院武汉430072

培养产朊假丝酵母菌收获菌体，经裂解酶处理细胞壁，离心后得到上清粒酶液，粗酶波经DEAE-纤维素层析、Sepharose4B凝胶过滤纯化。对33kd蛋白的酶学性质研究表明，反应最适pH为5．5，反应的最适温度为45℃。热稳定性较差，50℃温度下放... 详细信息

培养产朊假丝酵母菌收获菌体，经裂解酶处理细胞壁，离心后得到上清粒酶液，粗酶波经DEAE-纤维素层析、Sepharose4B凝胶过滤纯化。对33kd蛋白的酶学性质研究表明，反应最适pH为5．5，反应的最适温度为45℃。热稳定性较差，50℃温度下放置1h活力下降50％。主要水解β-1，3-倍苦键，具有较强的专一性，是一种典型的葡聚糖内切酶（对pNPG无作用）。

关键词： Candidautilis 细胞壁 β-1,3-葡聚糖酶酶学特性产朊假丝酵母 33kd蛋白酶活性

菠菜光系统Ⅱ33kd锰稳定蛋白结构与功能研究

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菠菜光系统Ⅱ33kD锰稳定蛋白结构与功能研究

作者：刘洪四川大学

学位级别：硕士

33 kd蛋白是光系统Ⅱ(PS Ⅱ)中三个重要的外周蛋白之一，具有维持锰簇的稳定和PS Ⅱ放氧活性所必需的作用。目前对33kd蛋白的溶液结构、与PS Ⅱ核心组分的结合是研究热点。本文对此作了探讨。首先，用荧光法研究了几种不同的盐溶液(CaCl... 详细信息

33 kd蛋白是光系统Ⅱ(PS Ⅱ)中三个重要的外周蛋白之一，具有维持锰簇的稳定和PS Ⅱ放氧活性所必需的作用。目前对33kd蛋白的溶液结构、与PS Ⅱ核心组分的结合是研究热点。本文对此作了探讨。首先，用荧光法研究了几种不同的盐溶液(CaCl、NaCl、脲、三氯乙酸、二硫苏糖醇)对33 kd蛋白构象的影响。研究结果显示，33 kd蛋白的唯一的色氨酸残基可能位于一个疏水环境中;33 kd蛋白的大部分酪氨酸残基也处于一个较为疏水的环境。维持33 kd蛋白溶液构象的作用力主要是疏水作用、二硫键。CaCl脲、三氯乙酸能够将33 kd蛋白从光系统Ⅱ洗下的原因是在它们的盐溶液中，33 kd蛋白的溶液构象，尤其在蛋白分子的C-末端，发生了较大变化。而NaCl对33 kd蛋白的C-末端的的构象影响较小，这可能是其不能将33 kd蛋白洗下的原因。二硫苏糖醇破坏二硫键会导致33 kd蛋白的构象发生了巨大的改变，表明二硫键的存在对维持33 kd蛋白的高级构象也是重要的。进一步的CD研究也表明，脲、二硫苏糖醇对33 kd蛋白的二级结构影响大，而NaCl却影响较小。接着，用N-溴代琥珀丙酰胺对Trp残基进行了化学修饰，并用多种实验手段检测了修饰带来的结构变化。SDS-PAGE显示，33 kd蛋白的表观分子量变大为34.5 kd;荧光、近紫外-CD谱、远紫外-CD谱较未修饰的33 kd蛋白均产生了明显的变化;酶解位点及酶解敏感性也发生了改变。这些结果表明，NBS修饰后，破坏了33 kd蛋白从C-末端的疏水结构，从而导致33 kd蛋白的结构可能变得更松散。疏水结构可能是由β-折叠形成，对33 kd在溶液中有利于结合到PS Ⅱ颗粒上的构象有重要作用，但疏水结构可能并不直接与PS Ⅱ作用。此外，差式扫描量热研究表明，33 kd蛋白可能有多个结构域，是一个“熔球体”蛋白。

关键词：光系统Ⅱ 33kd蛋白圆二色谱荧光差式扫描量热仪色氨酸

重金属离子Ag～+和Hg～（2+）与菠菜33kd锰稳定蛋白相互作用的研究

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重金属离子Ag～+和Hg～（2+）与菠菜33kD锰稳定蛋白相互作用的研究

作者：孟乐四川大学

学位级别：硕士

应用光谱学和生物信息学方法深入探讨了重金属离子Ag和Hg与菠菜光系统Ⅱ外周33kd锰蛋白的相互作用。本文首先利用荧光光谱、紫外差吸收光谱以及圆二色谱分析了溶液中33kd蛋白与Ag和Hg相互作用的动力学和热力学性质以及由金属离子结合所... 详细信息

应用光谱学和生物信息学方法深入探讨了重金属离子Ag和Hg与菠菜光系统Ⅱ外周33kd锰蛋白的相互作用。本文首先利用荧光光谱、紫外差吸收光谱以及圆二色谱分析了溶液中33kd蛋白与Ag和Hg相互作用的动力学和热力学性质以及由金属离子结合所引起的蛋白构象变化。在不同pH条件下(2.0—9.0),金属离子与33kd蛋白的相互作用有显著差异,表现为光谱学性质的不同。在所有pH条件下,Hg都能对蛋白内源荧光产生明显的淬灭效应,而Ag在pH2.0条件下反而使蛋白荧光强度上升,说明Ag和Hg对33kd蛋白内源荧光淬灭的方式或机制并不相同。金属离子对荧光光谱最大发射峰的位置影响不大,仅有±1nm的变化,表明金属离子的结合对33kd蛋白芳香族氨基酸残基的微环境仅有轻微影响。紫外差吸收光谱检测到明显的配体向金属的电荷转移(LMCT,ligand-to-metal charge transition)谱带。不同pH下Hg的LMCT带形状非常相似,但强度随着pH下降而显著上升;而Ag体系则呈现出完全相反的现象,LMCT带的强度随着pH的下降而下降,当pH2.0时甚至出现了负信号,这种现象还鲜有报道。LMCT谱带的结果表明33kd蛋白中存在着多个Ag或Hg的结合位点。对pH7.0条件下金属离子引起的33kd色氨酸荧光淬灭分析表明,由Ag和Hg引起的色氨酸荧光淬灭的机制主要是静态淬灭或非辐射能量转移。进一步分析表明引起色氨酸荧光淬灭的Hg的结合位点只有一个,且Hg极有可能是和两个半胱氨酸的硫原子配位,Hg中心位于两个硫原子中间,配位趋向于直线;而Ag的结合位点也只有一个,除了与两个半胱氨

关键词： 33kd蛋白荧光紫外圆二色谱结合位点

D_1-D_2-Cyt b_(559)复合物与33 kd蛋白重组时光谱性质研究

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生物物理学报 2004年第1期20卷 13-18页

作者：谭晓宏杜林方张年辉四川大学生命科学学院成都610064

将分离纯化的菠菜光系统ⅡD1-D2-Cytb559反应中心复合物和33kd外周蛋白按摩尔比1∶1或2∶1的比例进行体外重组,监测重组过程中的室温可见光区吸收光谱和荧光发射光谱的变化。结果表明:重组过程中,样品的室温可见光区吸收光谱几乎无变化... 详细信息

将分离纯化的菠菜光系统ⅡD1-D2-Cytb559反应中心复合物和33kd外周蛋白按摩尔比1∶1或2∶1的比例进行体外重组,监测重组过程中的室温可见光区吸收光谱和荧光发射光谱的变化。结果表明:重组过程中,样品的室温可见光区吸收光谱几乎无变化,但室温荧光发射光谱却有明显的变化,蛋白质内源荧光和叶绿素荧光的强度都有先增加后降低的现象,暗示33kd蛋白与D1-D2-Cytb559复合物在形成稳定的重组复合物之前,存在一个复杂的蛋白构象变化过程,重组时33kd蛋白与反应中心复合物的结合,可能影响了反应中心D1或D2色素蛋白所结合的叶绿素a等色素分子的微环境。

关键词：光系统II 反应中心复合物 33kd蛋白重组光谱性质植物

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重金属银离子对光系统Ⅱ作用部位研究

重金属银离子对光系统Ⅱ作用部位研究

作者：谭晓宏四川大学

学位级别：硕士

植物进行的光合作用是地球上最重要的化学反应，光系统Ⅱ(PSⅡ)是植物叶绿体上存在的最重要的膜蛋白复合物之一。研究PSⅡ的结构与功能对于将来提高作物的光能转化效率，仿生模拟太阳能利用具有重要的意义。重金属银离子是一种不可忽视... 详细信息

植物进行的光合作用是地球上最重要的化学反应，光系统Ⅱ(PSⅡ)是植物叶绿体上存在的最重要的膜蛋白复合物之一。研究PSⅡ的结构与功能对于将来提高作物的光能转化效率，仿生模拟太阳能利用具有重要的意义。重金属银离子是一种不可忽视的环境污染因子。本实验室曾发现AgNO能抑制PSⅡ颗粒的放氧活性，但具体原因不清。为了探讨Ag在PSⅡ中的作用部位，本文以菠菜(Spinacia oleracea L.)为材料，制备不同的PSⅡ制剂(PSⅡ颗粒和PSⅡ反应中心复合物)和33kd锰稳定蛋白，用溶液洗涤或透析除去Cl以避免样品中的Cl与Ag生成AgCl沉淀，借助室温吸收光谱、室温荧光发射光谱和SDS-PAGE，考察了外加AgNO处理对PSⅡ颗粒的光谱性质、多肽组分影响，以及对PSⅡ反应中心复合物、33kd锰稳定蛋白及两者重组产物复合物的影响，结果表明在PSⅡ中有多个Ag作用的部位。本文首先用不同浓度的AgNO处理PSⅡ颗粒，分析了处理前后PSⅡ颗粒的室温吸收光谱、蛋白质内源荧光、叶绿素荧光以及多肽组分的变化。结果显示：低浓度AgNO处理时PSⅡ颗粒的室温可见光区吸收光谱的最大吸收峰和室温荧光发射光谱最大发射峰的峰值均下降。同时观察到有部分33kd蛋白脱落的现象。再分别用不同浓度的AgNO处理33kd蛋白和PSⅡ反应中心D-D-Cyt b-559复合物，并检测光谱性质的变化。结果显示：AgNO处理使33kd蛋白紫外区吸收增加，并发生红移;278nm波长光激发时的蛋白质内源荧光峰减少，295nm波长光激发时荧光强度先升高后降低。AgNO处理使反应中心在蓝光区的吸收峰增加，而红光区吸收峰几乎不变;使反应中心的蛋白质内源荧光峰变化与33kd蛋白受处理后变化情况相似，436nm波长光激发的叶绿素荧光先升高后降低并蓝移。最后，AgNO处理重组的33kd-D-D-Cyt b-559复合物，与AgNO3处理Dl一DZ一Cytb一559反应中心复合物相比，吸收光谱的变化相似，但蛋白质内源荧光却随A叨03浓度的增加而逐渐减小;叶绿素荧光先升高后降低，并蓝移。这些结果表明银离子可以作用于分离的33kd蛋白，引起室温吸收光谱和蛋白质内源荧光的变化;作用于PSll反应中心Dl一DZ一cytb一559 复合物，引起室温吸收光谱、蛋白质内源荧光和叶绿素荧光的变化;作用于PSn 颗粒，使33kd蛋白脱落，样品的吸收光谱、蛋白质内源荧光和叶绿素荧光的降低。说明A犷对PSll的作用部位有多个。

关键词： PSII 33kd蛋白反应中心重金属银离子光谱性质作用部位

Low pH-induced conformational changes in 33 kd protein of photosystem Ⅱ

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Chinese Science Bulletin 2004年第9期49卷 921-925页

作者： WENGJun TANCuiyan YUYong RUANKangcheng XUChunhe InstituteofPlantPhysiology ShanghaiInstitutesforBiologicalSci-encesChineseAcademyofSciencesShanghai200032China LaboratoryofProteomics InstituteofBiochemistryandCellBiology.ShanghaiInstitutesforBiologicalSciencesChineseAcademyofSci-encesShanghai200031China

kd protein, located on the lumen side of thylakoid membranes, is one of three extrinsic proteins of photosystemⅡ(PSⅡ). Previous study showed that NBS modification of W241, the only tryptophan in 33 kd protein, is helpful for understanding the function of W241 in main-taining functional conformation of 33 kd protein. In this paper, studies of both circular dichroism and fluorescence spectra showed that upon decreasing pH from 6.2 to 2.5, the conformation of soluble 33 kd protein changed significantly, with an increase or a decrease in percentage of random coil or a-helix and turns. The changes in secondary structures of this protein are pH reversible. After NBS modification at pH 2.5, the conformational change of 33 kd protein was kept fixed. The CD ellipticity at 200 nm for NBS-modified 33 kd protein is much lower than that for control, indicating that the unfolding degree of 33 kd protein was enhanced after the NBS modification. Moreover, the conformational flexibility is lost in NBS-modified 33 kd protein, and the conformational change becomes pH irreversible, indicating that NBS modi-fication blocked the reversibility of conformational change of 33 kd protein. The specific binding capability of NBS-modi- fied 33 kd protein is much lower than that of low pH-treated control. Furthermore, the rebinding of modified protein on PSⅡ membranes cannot restore the activity of oxygen evo-lution. We suggest that it is low pH but not NBS modification of W241 that leads to the conformational change of 33 kd protein from one functional to another non-functional state. The significant capability of proton transport of 33 kd pro-tein is discussed.

关键词： NBS修正 33kd蛋白色氨酸功能性构象类囊体光合体系