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绵羊MHC classⅠ区段55L9 BAC克隆基因组成与结构研究

绵羊MHC classⅠ区段55L9 BAC克隆基因组成与结构研究

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作者：董慧芹石河子大学

学位级别：硕士

目的：以中国美利奴绵羊全基因组BAC文库中MHC classⅠ区段的55L9 BAC克隆为研究对象,通过对其进行末端32p标记制备探针,采用噬菌斑原位杂交方法,从中国美利奴细毛羊cDNA文库中筛选出一个或多个绵羊MHC classⅠ区段的基因,并对筛选到得... 详细信息

目的：以中国美利奴绵羊全基因组BAC文库中MHC classⅠ区段的55L9 BAC克隆为研究对象,通过对其进行末端32p标记制备探针,采用噬菌斑原位杂交方法,从中国美利奴细毛羊cDNA文库中筛选出一个或多个绵羊MHC classⅠ区段的基因,并对筛选到得候选基因进行测序及软件分析,从而初步研究绵羊MHC classⅠ区段55L9 BAC克隆基因组成与结构。友法：(1)对中国美利奴绵羊BAC文库中的MHC区段的55L9BAC进行测序,利用网上GeneScan1.0软件预测该克隆可能存在的基因。对该克隆进行质粒提取,酶切并用Klenow聚合酶对酶切产物进行32p末端标记。利用杂交技术筛选中国美利奴绵羊cDNA文库。 (2)对筛选获得到的候选阳性单克隆基因进行分子剪接,使基因克隆片段转化到pBK-CMV载体上,以便进一步的保存和测序工作。对转化后的载体质粒进行EcoR I/XhoⅠ双酶切鉴定,目的克隆片段送样测序后,利用各种生物信息学手段,对这些筛选得到的基因进行分析,并初步研究55L9BAC克隆的基因组成与结构特点。结果：55L9 BAC克隆测序结果显示,该克隆长约145kbp,共有12基因,这些基因大部分为断裂基因,其中有10个是完整基因,两端处的两个基因不完整,跨越其它克隆。经多次的原位杂交筛选,测序后,共获得15候选基因,其中有6个基因经软件比对后,被定位于55L9 BAC序列上,其它的基因虽没被定位在55L9 BAC序列上,但与NCBI上的核酸数据库比对后,显示这些基因与免疫可能有相关性,利用羊同牛在物种进化上的亲缘关系,对这些基因进行了基因注释。最后包括定位在55L9 BAC序列上的基因在内,共向GeneBnak提交了8个序列。结论：利用BAC文库与cDNA文库杂交的方法,在筛选基因方面有很大优势,首先它可以分离到全长基因进而可以展开基因功能的研究;其次是一种从文库中快速性筛选阳性克隆的有效手段,特别适应于非常大量的克隆筛选。

关键词： MHC BAC文库 cDNA文库 32p放射性探针噬菌斑原位杂交

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