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RECK基因3′utr荧光素酶报告基因载体的构建

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中国生物制品学杂志 2018年第3期31卷 247-250,256页

作者：伊丽娜刘睿张烜昌妍希孙鹏内蒙古医科大学药学院内蒙古呼和浩特010100 内蒙古医科大学基础医学院内蒙古呼和浩特010100

目的构建RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs)基因mRNA 3′非编码区(3′-untranslated region,3′utr)全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,以进一步研究microRNA对RECK基因的调控。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7基因组DNA为模板,PCR扩增RECK基因mRNA的3′utr全长及两个截短片段,利用双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR、双酶切、测序鉴定重组子,双荧光报告基因检测其表达活性。结果重组载体中RECK3′utr序列与GenBank序列比对一致且插入方向正确;3个重组载体分别命名为pGL3-RECK 3′utr-1、pGL3-RECK3′utr-2和pGL3-RECK 3′utr-3,转染细胞后可表达荧光素酶基因。结论成功构建了RECK基因3′utr全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,为进一步研究microRNA对靶基因RECK的调控奠定了基础。

关键词： RECK基因 3′utr 荧光素酶报告基因 microRNA

草原红牛胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因3′utr序列多态性分析

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中国畜牧兽医 2010年第7期37卷 103-106页

作者：张金玉秦立红张国梁赵玉民张嘉保赵志辉吉林大学畜牧兽医学院长春130062 吉林省农业科学院公主岭136100

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′utr序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′utr中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的... 详细信息

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′utr序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′utr中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的相关性分析结果发现,在3′utr中AB型的胴体产肉率、肉骨比显著高于AA、BB型(P0.05)。

关键词：草原红牛 IGF-ⅠR基因 3′utr 多态性分析

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猪ERK6基因3′utr的克隆及序列分析

黑龙江畜牧兽医 2010年第5期 9-11页

作者：曾瑞霞付长红史平军苏玉虹辽宁医学院解剖学教研室辽宁锦州121001 枣庄市市立医院妇产科山东枣庄227000 枣庄市市中区疾控中心山东枣庄227000

为了给猪ERK6基因的功能研究提供信息资料,试验以已报道的猪ERK6基因CDS序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增了猪ERK6基因3′utr序列,并采用DNAMAN、DNASTAR及CLUSTALW2软件分析序列特征。结果表明:分离的产物共827bp,包含部分编码区28... 详细信息

为了给猪ERK6基因的功能研究提供信息资料,试验以已报道的猪ERK6基因CDS序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增了猪ERK6基因3′utr序列,并采用DNAMAN、DNASTAR及CLUSTALW2软件分析序列特征。结果表明:分离的产物共827bp,包含部分编码区281bp、3′utr序列439bp、poly(A)60、接头引物47bp,将前三部分序列共780bp上传至GenBank,登录号为NM_001025224;此序列poly(A)60位点上游14个核苷酸处有CPSF结合位点,与人、鼠3′utr序列的相似性为41%、48%。说明分离获得的片段为猪ERK6基因的3′utr序列。

关键词：猪 ERK6基因 3′utr

心脏圆锥动脉干畸形患儿TBX1C基因3'utr区域突变分析

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上海交通大学学报（医学版） 2014年第6期34卷 767-771页

作者：方绍海徐月娟曹瑞雪陈笋徐让上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科上海200092 上海交通大学医学院附属新华医院科研中心上海200092

目的筛查心脏圆锥动脉干畸形(CTHD)患者中TBX1C基因3'utr区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法选取无22q11.2区微缺失的52例CTHD患儿(CTHD组)和89名健康儿童(对照组)作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3... 详细信息

目的筛查心脏圆锥动脉干畸形(CTHD)患者中TBX1C基因3'utr区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法选取无22q11.2区微缺失的52例CTHD患儿(CTHD组)和89名健康儿童(对照组)作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3'utr区序列,所有扩增片段均进行双向测序;将测序结果与GenBank中TBX1C 3'utr序列(NM 080647.1)进行比对,筛查出可能存在的基因突变;PicTar和TargetScan在线预测软件预测可能与TBX1C基因3'utr区结合的微RNA(miRNA),分析TBX1C基因3'utr区突变对miRNA调控TBX1C基因表达的影响。结果在CTHD组中发现1例突变c.*164_*165insC,即在距离终止密码子164位与165位核苷酸之间插入1个胞嘧啶;该突变在对照组中不存在,其他研究中未见报道,为新发突变;预测结果显示10种miRNA能与TBX1C基因3'utr区结合,该突变并不位于10种miRNA与TBX1C3'utr的结合区域。结论 TBX1C基因3'utr区域存在新发突变c.*164_*165insC,该突变可能改变TBX1C3'utr区域与miRNA结合的空间构象,进而影响miRNA对TBX1C基因表达的调控作用。

关键词：圆锥动脉干畸形 TBX1基因基因突变 3′utr 微RNA

HLA-G基因3’utr插入/缺失多态与肝细胞肝癌易感性关联研究及功能分析

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HLA-G基因3’UTR插入/缺失多态与肝细胞肝癌易感性关联研究及功能...

作者：姜玉婷苏州大学

学位级别：硕士

目的：研究HLA-G基因3′utr区域的一个14-bp插入/缺失多态（rs66554220）与中国人群肝细胞肝癌（HCC）易感性的关联，并利用基因型-表型关联研究及生物信息学方法探讨该多态参与肝细胞肝癌发生的功能及意义。方法：（1）运用生物信... 详细信息

目的：研究HLA-G基因3′utr区域的一个14-bp插入/缺失多态（rs66554220）与中国人群肝细胞肝癌（HCC）易感性的关联，并利用基因型-表型关联研究及生物信息学方法探讨该多态参与肝细胞肝癌发生的功能及意义。方法：（1）运用生物信息学工具筛选出了HLA-G基因3′utr区域内的多态，并从中选取一个具有潜在功能的14-bp插入/缺失（Indel）多态位点（rs66554220）作为候选多态;（2）采用病例对照研究方法（318HCC病例和599例正常对照），PCR扩增结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对候选多态进行基因分型，Logistic统计分析基因多态位点与HCC的关联性;（3）运用免疫组织化学法研究肝细胞肝癌组织中rs66554220多态与HLA-G表达量的基因型-表型关联;（4）运用生物信息学的方法预测rs66554220多态位点可能结合的miRNAs。结果：（1）基因分型结果显示，位于HLA-G基因3′utr区域内的rs66554220位点具有较好的多态性，病例组中rs66554220位点14-bp插入（Ins）和14-bp缺失（Del）的等位基因频率分别为0.234，0.766;正常组分别为0.291，0.709。病例组和对照组中rs66554220位点的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）;（2）调整性别、年龄、吸烟、饮酒、HBV感染以及肿瘤分期等主要风险因素后，运用Logistic回归分析的方法对实验数据进行统计分析，统计结果显示：与14-bpDel/Del纯合子相比，14-bpIns/Ins纯合子个体HCC易感性明显降低（OR=0.54，95%CI：0.30–0.98，P=0.031）;等位基因水平分析显示，与Del等位基因相比，携带Ins等位基因的个体患HCC的风险亦明显降低（OR=0.74，95%CI：0.59–0.93，P=0.009）。HBV的分层分析发现，这种阳性关联在HBV感染人群中更显著;（3）免疫组织化学结果显示，肝癌组织中Del/Del纯合子组HLA-G表达水平最高[2.67（2.13–2.95）]，Ins/Del杂合子组表达次之[1.64（1.02–1.81）]，Ins/Ins纯合子组最低[1.59（0.98–1.75）]，HLA-G表达水平在Del/Del组与Ins/Ins组之间存在显著性差别（P＜0.01）;（4）生物信息学预测结果提示， rs66554220多态可以被25个miRNAs特异性结合，其中G差值大于4.00Kcal/mol的有7个， G差值较大的为hsa-miR-668（|G|=7.50Kcal/mol）和hsa-miR-557（|G|=5.34Kcal/mol）。结论：（1）中国人群中rs66554220多态与肝细胞肝癌易感性存在显著关联，这种关联在HBV感染患者中更为明显;（2）肝癌组织中HLA-G的表达量与rs66554220多态之间存在显著的基因型-表型关联（;3）rs66554220多态可能通过影响特定miRNAs与其靶基因（HLA-G）的结合，从而实现对HLA-G的表达的调控，进而参与HCC发生。

关键词： HLA-G基因肝细胞肝癌基因多态 3′utr miRNAs

Ddit43′utr双荧光素酶报告基因质粒的构建及调控microRNA的鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第12期34卷 1437-1442页

作者：孙雨晴王宇飞宋美燕张娟张丽李美宁白云刘志贞山西医科大学生物化学与分子生物学教研室山西太原030000 山西省妇幼保健院妇产科山西太原030000

目的构建Ddit4基因双荧光素酶报告基因质粒,并验证miR-222-3p与Ddit4的靶向调控关系。方法利用生物信息学软件预测miR-222-3p与Ddit4的结合位点;PCR扩增Ddit43′utr序列,将其克隆至双荧光素酶GPmiRGLO报告基因载体中,同时构建Ddit43′UT... 详细信息

目的构建Ddit4基因双荧光素酶报告基因质粒,并验证miR-222-3p与Ddit4的靶向调控关系。方法利用生物信息学软件预测miR-222-3p与Ddit4的结合位点;PCR扩增Ddit43′utr序列,将其克隆至双荧光素酶GPmiRGLO报告基因载体中,同时构建Ddit43′utr突变载体;将miR-222-3p、双荧光素酶报告质粒野生型和突变型mmu-Ddit43′utr共转染至HT-22细胞中,酶标仪检测双荧光素酶荧光值。结果生物信息数据库预测结果显示,miR-222-3p与Ddit4基因3′utr存在互补结合位点,载体测序证实双荧光素酶Ddit4报告载体构建成功;双荧光素酶试验表明,miR-222-3p mimics能够与野生型Ddit4基因3′utr靶向结合并降低其荧光值,将靶位点进行突变后,其荧光值有所上升。结论miR-222-3p与Ddit4基因3′utr互补结合实现了其对Ddit4靶向调控的作用;miR-222-3p可能通过调控Ddit4进而参与NTDs的发生发展。

关键词： miR-222-3p Ddit4基因 3′utr 双荧光素酶报告载体

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鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

病毒学报 2007年第4期23卷 312-319页

作者：丁春宇张大丙中国农业大学动物医学院农业部预防兽医学重点开放实验室北京100094

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′utr,而poly（A）尾分别含18... 详细信息

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′utr,而poly（A）尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%-37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围（18%-60%）之内;此外,Ⅰ型DHV的3′utr在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。

关键词：鸭肝炎病毒 3D基因 3′utr poly(A) 3′RACE

RNA结合蛋白的CLIP-seq数据的生物信息学分析流程建立及初步应用

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中国科学：生命科学 2021年第4期51卷 450-461页

作者：谢正尧臧敏李鑫徐宇君南京医科大学生殖医学国家重点实验室南京211166

近年来,紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(UV cross-linking immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing, CLIP-seq)成为鉴定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)的靶标序列和结合位点的新技术,为研究RNA结合蛋白功能、解析其分子机制提供了强有力的工具.尽管国际上已有应用CLIP技术的报道,但是实验方法周期长、技术性强,尤其是后续的数据处理和生物信息学分析令没有计算机基础和专职生物信息分析人员的实验室望而却步.基于2016年Van Nostrand等人优化的CLIP方法,本团队建立并完成了多个RBP在组织和细胞中的CLIP测序及数据的生物信息学分析流程,并验证了其可行性.本研究整合了多家实验室已公开发表的分析软件和脚本,对人前列腺癌DU145细胞系中的PUMILIO1(PUM1)蛋白CLIP-seq数据进行分析,总结出对于蛋白功能分析更有效的命令和参数,并建立了完整的生物信息学分析流程.运用该流程寻找PUM1蛋白在人前列腺癌发展中的潜在机制,本团队识别出PUM1在DU145细胞系中的1189个靶标,并发现PUM1主要结合其靶标mRNA的3′非翻译区(untranslated region, utr)和转录终止位点(transcription termination sites, TTS)区域, UGUAHAUA(H代表A/U/C)基序(motif)为PUM1蛋白识别的特征性序列. PUM1可能通过结合靶标mRNA的3′utr对靶标进行转录后调控,参与癌细胞的生长、分化等过程以及相关的癌症通路中.本团队还发现, PUM1在人前列腺癌细胞系中能够与其他物种或组织中类似的靶标结合,并且结合方式高度一致,这与该家族蛋白在RNA结合功能域和功能上的高度保守性相符合.因此,本文报道的技术方法和生物信息学分析流程可以为有兴趣开展RBP的靶标鉴定的研究人员提供一个一站式的方法学服务平台,也有助于推动转录后调控在疾病和发育中的机制研究和RBP的RNA调控等新兴领域的发展.

关键词： RNA结合蛋白紫外交联免疫沉淀高通量测序生物信息学 PUM1 前列腺癌 3′utr

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靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

畜牧兽医学报 2015年第8期46卷 1281-1289页

作者：戴丽荷褚晓红路伏增黄孙平徐如海浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江省畜禽遗传育种工程技术研究中心杭州310021

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′utr序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′utr序... 详细信息

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′utr序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′utr序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′utr序列的重组载体pMIR-ATGL-3′utr,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′utr的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′utr上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′utr对猪ATGL基因有下调作用。

关键词：猪 ATGL基因 miRNA 双荧光素酶报告基因系统 3′utr