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ERCC1及其重叠基因3’端非编码区多态性与结直肠癌发病风险关联的病例对照研究

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中国医科大学学报 2021年第4期50卷 289-294,301页

作者：张靖悦张倩也陈信桢张国培肖明扬逯晓波中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室沈阳110122

目的探讨切除修复交叉互补基因1(ERCC1)及其重叠基因CD3EAP、PPP1R13L的3’端非编码区(3’UTR)单核苷酸多态性(SNP)与结直肠癌(CRC)发病风险的关联性。方法根据最小等位基因频率(MAF)及样本量确定候选SNP位点。收集200例CRC患者(病例组)... 详细信息

目的探讨切除修复交叉互补基因1(ERCC1)及其重叠基因CD3EAP、PPP1R13L的3’端非编码区(3’UTR)单核苷酸多态性(SNP)与结直肠癌(CRC)发病风险的关联性。方法根据最小等位基因频率(MAF)及样本量确定候选SNP位点。收集200例CRC患者(病例组)和200名健康对照受试者(对照组),利用非条件logistic回归模型分析靶基因候选SNP位点与CRC的关联。结果ERCC1基因SNP位点rs3212986与CRC发生风险相关,与rs3212986 CC基因型相比,AA基因型携带者患CRC的风险增高(P3212986、rs2336219、rs735482、rs1007616区域单体型结构CCAC、AAGC、CAGT患CRC风险程度高于野生型(P3212986位点AA基因型在CRC病例中的出现频率高于对照,其A等位基因会增加CRC的患病风险。ERCC1单体型AAG与CRC的易感性相关。19q13区域单体型结构CCAC、AAGC、CAGT与CRC易感性相关,可能增加CRC的患病风险。

关键词：结直肠癌单核苷酸多态性切除修复交叉互补基因1 3’端非编码区重叠基因

IBDV超强毒株GX8/99株VP3基因及其A节段3’端非编码区基因与致病性的关系

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IBDV超强毒株GX8/99株VP3基因及其A节段3’端非编码区基因与致病...

作者：王伟山东农业大学

学位级别：硕士

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官(法氏囊),导致免疫抑制。1957年本病首次在美国的特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中... 详细信息

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官(法氏囊),导致免疫抑制。1957年本病首次在美国的特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发生,20世纪80年代美国又发现了变异株,欧洲国家首先报道有超强毒株(vvIBDV)出现,90年代初vvIBDV传至中国及亚洲其它国家和地区。IBD给养鸡业带来了巨大的经济损失。为探讨vvIBDV基因变异与致病性之间的关系,本研究以vvIBDV GX8/99株为研究对象,将vvIBDV GX8/99株进行传代,研究从原始毒(鸡源毒)→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→回传SPF鸡传代毒(鸡源毒)一个轮回各代次毒VP3、A节段3’端非编码区核苷酸及氨基酸与致病性之间的关系,这将为进一步构建含有人工突变的特定基因片段或基因位点的IBDV传染性克隆,从而反证与IBDV毒力基因相关的位点提供依据。本研究共分2部分:一、GX8/99株原始毒及传代毒VP3基因与致病性的关系:为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性与其VP3基因变化的关系,将vvIBDV GX8/99株囊毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传至23代时开始引发CEF细胞病变,随之用无限稀释法连续克隆2次后获得病毒克隆,再将该克隆化病毒分别连续回传3～5周龄SPF鸡20代。分别比较细胞毒及其克隆化毒回传SPF鸡后不同传代毒中VP3氨基酸分子的变化。结果表明:相对于原始囊毒,细胞毒(C25)在测序的VP3区域中有4个位点发生突变,并且变得与疫苗毒D78完全一致。而在回鸡的过程中,4个突变位点中的大多数氨基酸不再发生变化,而第228位氨基酸在细胞致弱过程中由P突变为细胞适应毒的L后,在回鸡过程中又变回P(B15)。这初步揭示了VP3中的氨基酸变异与病毒的致病性有一定关系,而且也可能与细胞培养过程中及SPF鸡传代过程中组织的亲和性有一定的关系。二、GX8/99株原始毒及传代毒A节段3’端非编码区基因与致病性的关系:为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性与其A节段3’端非编码区基因变化的关系,本试验对vvIBDV GX8/99株各代次毒中A节段3’端非编码区氨基酸序列进行了比较,结果表明:与超强毒HK46、D6948和GX株相比, GX8/99株的第20位氨基酸L为特有的,而与Cu-1M、P2、CEF94等弱毒株一致,且该位点在整个传代过程中比较稳定、没有突变。GX8/99株囊毒与其细胞适应毒(C25)、克隆化毒(CL),回鸡毒的10代毒(B10)、15代毒(B15)、20代毒(B20)相比, A节段3’端非编码区的31个氨基酸均没有发生任何突变。因此可以初步判定A节段3’端非编码区与致病性没有关系,而且与细胞或组织的亲和性也没有关系。

关键词：超强毒鸡传染性法氏囊病毒 VP3 3’端非编码区氨基酸

牛病毒性腹泻病毒蛋白对其非编码区的调节作用

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牛病毒性腹泻病毒蛋白对其非编码区的调节作用

作者：宋现梅山东师范大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhea),又名为粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写BVDV)引发的具有传染性的疾病,给全世界的养牛产业带来了巨大的经济损失,世界动物卫生组织将其界定为B类传染病。牛病毒性腹... 详细信息

牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhea),又名为粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写BVDV)引发的具有传染性的疾病,给全世界的养牛产业带来了巨大的经济损失,世界动物卫生组织将其界定为B类传染病。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)隶属于黄病毒科瘟病毒属,直径为25-30nm,是一个具有包膜的单股正链RNA病毒,其基因组长度约为12.3kb,是由5′非编码区、开放阅读框(ORF)及3′非编码区构成的。其中ORF是能编码近3900个氨基酸的一个多聚蛋白,在宿主蛋白酶与自身蛋白酶的作用下,这个多聚蛋白可被分割成12个蛋白,依次为Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中C、Erns、E1、E2是结构蛋白,可以和基因组RNA、脂膜一起构成病毒粒子,在病毒与受体之间起着重要作用。而其余8种是非结构蛋白,在病毒复制时发挥作用,其中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B是复制过程必需的,其余三种是非必需的。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的非编码区在RNA转译开始及稳定性方面均起着主要的作用。其中5’-末端有内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES),可以指导多聚蛋白的合成;3’末端的3V基序在病毒RNA复制、翻译终止方面起着重要的作用。本研究中首先对获得的BVDV病毒进行了基因型鉴定,发现其为I型BVDV,其序列与NCBI库中的Bovine viral diarrhea virus 1 strain Singerrg,complete genome(GenBank:DQ088995.2)的一致性达到99%,由此可根据Bovine viral diarrhea virus 1 strain Singerrg,complete genome的基因序列进行分段引物设计,之后应用PCR、基因测序以及基因组拼接技术等可将各分段基因进行拼接得到BVDV病毒的全基因组序列。其次,又依据拼接组成的BVDV病毒的全基因组序列设计了12个蛋白及两个非编码区的引物,然后应用PCR、基因测序技术等成功得到了它们的目的片段,并将这12个蛋白克隆到真核表达载体pCMV-HA上成为蛋白真核表达质粒,同时将两个非编码的基因连接到荧光素酶表达载体pMIR-report上成为荧光素酶表达载体,以便进行后续的探索。最后,在翻译水平上先检测了牛病毒性腹泻病毒3’UTR在PK15细胞中的活性,发现牛病毒性腹泻病毒3’UTR能显著抑制翻译效率。之后探究了牛病毒性腹泻病毒各个蛋白对其3’UTR的调节作用,将本研究中成功构建的牛病毒性腹泻病毒8个蛋白的真核表达载体分别与其3’UTR的荧光素酶表达载体进行细胞共转染,将其导入PK-15细胞中,根据测定的荧光素酶活性水平高低来判断哪些蛋白对3’UTR的功能起了调节作用。由分析结果可知,牛病毒性腹泻病毒NS2、NS4B、NS5A、C和Erns蛋白均对其3’UTR起到明显的调节作用。其中NS4B、NS5A、C和Erns蛋白显著降低了3’UTR的翻译抑制功能,据此推断出NS4B、NS5A、C和Erns蛋白促进了病毒的翻译;而NS2蛋白明显增强了3’UTR的翻译抑制功能,由此推断NS2蛋白阻碍了病毒的翻译。总之,本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统发现了牛病毒性腹泻病毒NS2、NS4B、NS5A、C和Erns蛋白均对其3’UTR在翻译水平上的功能起到了显著的调节作用。

关键词：牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻病毒 3’端非编码区

制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

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中国肺癌杂志 2010年第5期13卷 470-476页

作者：汪惠赖百塘李伟英杨学惠张春燕韦攀健李金照北京市结核病胸部肿瘤研究所北京101149 中国科学院生物物理所北京100101

背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺... 详细信息

背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。

关键词：野生型p53 缺失C-末端p53 3’端非编码区重组腺病毒流式细胞仪散点图绿荧光蛋白表达

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

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中国兽医学报 2003年第6期23卷 524-526页

作者：刘光清刘在新谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃兰州730046

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终... 详细信息

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 3’端非编码区序列分析 3’RACE方法基因克隆同源性 3’末端序列

Race法扩增4株鸭肝炎病毒3′末端序列及其克隆分析

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浙江农业学报 2009年第3期21卷 225-229页

作者：邵泽香韦强崔言顺鲍国连刘燕季权安山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序... 详细信息

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序结果表明，扩增的特异性片段长度为597nt（不包括polyA尾巴）。各毒株3’UTR均为315nt，位于终止密码子TGA之后，比对分析结果表明各毒株间的同源性较高；4株DHV 3’末端核苷酸序列（不包括polyA尾巴）之间的同源性为96．3％～100％，而与参考毒株之间的同源性为93．5％～99．7％。在系统发生进化树上，各毒株亲缘关系较近。

关键词： 3’RACE 鸭病毒性肝炎病毒序列比对分析 3’端非编码区 Poly(A)

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猪瘟病毒蛋白对其3’UTR的调节作用

猪瘟病毒蛋白对其3’UTR的调节作用

作者：麻甜甜山东师范大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引发的一种疾病,具有高致病性和高传染性,可对猪类养殖业带来严重的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病。猪瘟病毒是一种单股正链RNA病毒,其基因... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引发的一种疾病,具有高致病性和高传染性,可对猪类养殖业带来严重的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病。猪瘟病毒是一种单股正链RNA病毒,其基因组包括一个开放阅读框(open reading frame,ORF),一个3’端非编码区(3’untranslated region,3’UTR)和一个5’端非编码区(5’untranslated region,5’UTR)。猪瘟病毒的开放阅读框编码一个由3898个氨基酸所组成的多聚蛋白,该多聚蛋白可在病毒自身蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的水解和修饰作用下形成12个成熟的蛋白,包括C、Erns、E1、E2、Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。猪瘟病毒基因组的复制过程需要多种自身非结构蛋白的参与,研究表明NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B是猪瘟病毒RNA复制所必需的。猪瘟病毒3’UTR的二级结构包括4或5个茎环结构(stem loop,SL),对病毒RNA的复制和翻译有着重要作用。为了研究猪瘟病毒各个蛋白对其3’UTR在翻译水平的调节作用,本研究构建了猪瘟病毒各蛋白的真核表达载体和3’UTR的荧光素酶表达载体,并将各蛋白的真核表达载体分别与3’UTR的荧光素酶表达载体共转染至PK-15细胞,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析各蛋白对3’UTR的功能是否具有调节作用。结果显示猪瘟病毒C、NS4A、NS5A和NS5B蛋白对其3’UTR的功能具有显著的调节作用。其中C蛋白和NS5B蛋白可以显著降低3’UTR的翻译抑制功能,因此推测C蛋白和NS5B蛋白对病毒的翻译起到促进作用;而NS4A、NS5A蛋白可以促进3’UTR的翻译抑制功能,推测对病毒的翻译起到抑制作用。为了进一步研究猪瘟病毒C蛋白对其3’UTR在翻译水平的调节作用,首先研究C蛋白在3’UTR上的具体调节位点。通过构建3’UTR不同茎环区域调控下的荧光素酶表达载体,并与C蛋白的真核表达载体共转染后,发现C蛋白对其3’UTR的调节位点主要定位于3’UTR的1-139nt区(SL-1和SL-2)。同时也研究了猪瘟病毒C蛋白对3’UTR发挥调节作用的主要功能区域。利用生物信息学对C蛋白进行分析,发现59-69位氨基酸为C蛋白的氨基酸保守区,对该区域进行缺失突变后,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析,结果显示猪瘟病毒C蛋白的59-69位氨基酸对于C蛋白在3’UTR的调节过程中起到较为重要的作用。总之,本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统发现猪瘟病毒C蛋白对其3’UTR在翻译水平的功能具有显著的抑制作用,推测对病毒的翻译可起到促进作用,且该调节作用主要定位于3’UTR的1-139nt(SL-1和SL-2)区域;C蛋白中的第59-69位氨基酸在此调节作用中发挥了较为重要的作用。

关键词：猪瘟猪瘟病毒 3’端非编码区 C蛋白

制备两种P53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

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结核病与胸部肿瘤 2010年第2期 77-83页

作者：汪惠赖百塘李伟英杨学惠张春燕韦攀健李金照北京市结核病胸部肿瘤研究所中国科学院生物物理所

目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流... 详细信息

目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流式细胞仪散点图（Flow cytometry scatter plot，FCM）检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）表达。材料和方法利用pAdEasy-Track载体系统，构建两种P53重组质粒并在细菌中产生重组体，转染L293细胞产生三种重组腺病毒。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞，FCM分析GFP表达。结果测序证明重组腺病毒：Ad—P53（del）缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区，Ad—P53（wtp）没有P53碱基缺失。Ad（empty carrier）无P53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端P53和全长p53两种重组腺病毒，Ad—p53（del），Ad-p53（wtp）及空载体Ad-（empty）。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠，可定量外源GFP表达，为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。

关键词：野生型P53 缺失C-末端P53 3’端非编码区重组腺病毒流氏细胞仪散点图绿荧光蛋白表达

HCLV在PK-15细胞中的滴度和12nt的变化

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中国畜牧兽医 2007年第12期34卷 59-61页

作者：亢文华郝俊峰潘春刚宁宜宝中牧股份实业有限公司北京100070 中国科学院生物物理研究所北京100101 中国兽医药品监察所北京100081

在PK-15细胞上连续传代获得的HCLV,从第1～25代病毒的测序结果一致,同源性为100%。从第26代开始在12-nt(ttttttctttttt)插入处出现变化,第26、27代在69位碱基C的左右各多插入了一个T;第28、29代在碱基C的右侧多插入了2个T;第30、31代在... 详细信息

在PK-15细胞上连续传代获得的HCLV,从第1～25代病毒的测序结果一致,同源性为100%。从第26代开始在12-nt(ttttttctttttt)插入处出现变化,第26、27代在69位碱基C的左右各多插入了一个T;第28、29代在碱基C的右侧多插入了2个T;第30、31代在C的左侧多插入了6个T,碱基C也变成了T;第32、33代在C的右侧缺失了2个T,碱基C也缺失;第34代在C的左侧缺失了5个T,在C的右侧缺失了5个T,碱基C也缺失,并且在第86位由原来的A变成G,第92位由原来的T变成C。将HCLV1～34代病毒接种24孔板中长满单层的PK-15细胞,于接种后72h进行荧光抗体检查,比较不同代次HCLV在PK-15细胞上增殖的差异。结果发现,从28代开始病毒滴度有所下降。

关键词：猪瘟兔化弱毒株 3’端非编码区 RT-PCR 序列测定