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带状疱疹疫苗生产中2bs细胞细胞工厂培养工艺的建立

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中国生物制品学杂志 2014年第11期27卷 1485-1487,1492页

作者：梁雪刘延威张宇石磊杨晓叶李生军沈红杰长春祈健生物制品有限公司吉林长春130012

目的建立带状疱疹疫苗生产中2bs细胞在细胞工厂中的培养工艺。方法将2bs细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行... 详细信息

目的建立带状疱疹疫苗生产中2bs细胞在细胞工厂中的培养工艺。方法将2bs细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行细胞计数。取细胞工厂,按MOI 0.008接种水痘-带状疱疹病毒,制备成带状疱疹减毒活疫苗,检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验;采用酶联免疫法检测抗生素残留量和牛血清白蛋白残留量;凝胶法检测内毒素含量;水分容量滴定法检测水分含量。结果 2bs细胞按1∶2比例传代,细胞工厂单层加液量为300 ml,可制备单层致密、优质的细胞,细胞工厂收获时细胞病变达80%以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,且1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃稳定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6 lg PFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求。结论建立了带状疱疹疫苗生产中2bs细胞在细胞工厂中的培养工艺,利用细胞工厂可制备出质量均一、致密优质的2bs细胞。

关键词：带状疱疹疫苗 2bs细胞细胞工厂

两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2bs细胞的敏感性

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中国生物制品学杂志 2014年第11期27卷 1459-1462页

作者：梁慧颖隋波赫宝双梁雪李生军张宇杨晓叶沈红杰长春祈健生物制品有限公司吉林长春130012

目的用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）（Oka株）毒种,比较两种方法制备的毒种对2bs细胞的感染复数及増殖动态差异。方法用现有方法（用含2%小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种... 详细信息

目的用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）（Oka株）毒种,比较两种方法制备的毒种对2bs细胞的感染复数及増殖动态差异。方法用现有方法（用含2%小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种）和新方法（用含90%小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种）制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI（0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1）感染第37代2bs细胞,观察细胞病变（CPE）情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2bs细胞感染的最适MOI。结果现有方法制备毒种以0.01~0.1 MOI感染2bs细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001~0.01 MOI感染2bs细胞72 h后,病变达到高峰期。两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4~4.6 lg PFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8~4.0 lg PFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准。结论现有方法和新方法制备的毒种最适MOI分别为0.01~0.1和0.001~0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产。

关键词：水痘-带状疱疹病毒 2bs细胞感染复数病毒滴度

森林脑炎病毒2bs细胞适应株全基因序列分析

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中国生物制品学杂志 2022年第5期35卷 539-543页

作者：王颖王斌陈娜娜魏辉徐艳玲李景良邹勇长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130062 吉林大学白求恩第一医院感染科吉林长春130021

目的分析“森张”株森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)适应2bs细胞传代后的全基因序列。方法将“森张”株TBEV感染2bs细胞,经蚀斑克隆纯化,并连续传代培养。提取适应2bs细胞培养后的TBEV RNA,反转录为cDNA,以其为模板进... 详细信息

目的分析“森张”株森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)适应2bs细胞传代后的全基因序列。方法将“森张”株TBEV感染2bs细胞,经蚀斑克隆纯化,并连续传代培养。提取适应2bs细胞培养后的TBEV RNA,反转录为cDNA,以其为模板进行PCR扩增,扩增产物进行测序鉴定,并应用DNAMAN和MEGA软件对所获得序列进行分析。结果获得2bs细胞适应株TBEV全基因序列,共10782个碱基,编码3414个氨基酸;与鼠脑适应株TBEV全基因序列比对,2bs细胞适应株TBEV的5'和3'端非编码区(UTR)分别有1个碱基突变;结构蛋白区域有5个碱基突变,导致3个氨基酸变异;非结构蛋白区域有31个碱基突变,导致9个氨基酸变异。与主代鼠脑适应株核苷酸序列同源性为99.63%,氨基酸同源性为99.56%。结论“森张”株TBEV适应2bs细胞传代后,在分子水平方面证明相对于鼠脑适应株TBEV基因稳定,为2bs细胞森林脑炎疫苗的研发奠定了基础。

关键词：森林脑炎病毒 2bs细胞全基因序列分析

五种中药的水提物主要成分对2bs细胞的抗衰老作用

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五种中药的水提物主要成分对2BS细胞的抗衰老作用

作者：刘伟萍郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的衰老是一种由遗传因素和内外环境多种复杂因素相互作用而引起的生物学过程,是生命周期中按照一定的规律发生在整体、器官、组织、细胞的形态功能的演变过程,表现为一系列随增龄而显示的全身性、渐进性、衰退性的变化或紊乱。... 详细信息

背景与目的衰老是一种由遗传因素和内外环境多种复杂因素相互作用而引起的生物学过程,是生命周期中按照一定的规律发生在整体、器官、组织、细胞的形态功能的演变过程,表现为一系列随增龄而显示的全身性、渐进性、衰退性的变化或紊乱。关于人体衰老,是一个久经不衰的热门话题。长期以来,人们对人体衰老的起因、机制进行了不断的探索和研究,但迄今为止仍是一个尚未完全解开的谜。探索衰老发生的机制既是一个古老的问题,又是一个崭新的科研领域。随着近年来中医药学科的快速发展,以及人们崇尚自然养生理念的流行,使用中药材或药食两用食材进行养生延缓衰老拥有很好的研究前景。河南地域广阔,地理位置特殊,地形复杂,南北气候交错,形成南北区域兼容并存的丰富中药资源。大枣,金银花,四大怀药等产量丰富且质优,对于其功效的研究有助于因地制宜的发展本地经济。中药血清药理学是在整体动物给药一段时间后,取含药成分的血清代替中药粗提物进行体外实验的一种方法。自从1991年我国国家中医药管理局对此立题以来,这项研究已得到系统的开展。中药血清药理学的优势在于:体现了复方在体内系列转化效应,克服了药物本身的理化性质对实验研究的直接干扰。细胞像其他生物体一样,有一定的寿命。正常人的二倍体成纤维细胞在体外培养条件下,经历有限的分裂次数,进入一种不可逆的增殖停滞状态,即复制性衰老。这种在体外培养的细胞增殖传代的能力,反应了细胞在体内的衰老状况。因此,人二倍体成纤维细胞被公认为研究细胞衰老的模型。实验方法1.水提物的制备及检测:对大枣,金银花,山药,菊花,地黄进行热水浸提,取上清液减压浓缩除脂醇沉,分别得其水提物。对各水提物进行成分检测分析,对比标准品检测其含量。采用邻苯三酚自氧化法对各水提物进行体外抗自由基能力测定。2.含药血清的制备:日本大耳白兔雌性若干只,分为各药物组、空白对照组。药物组以适量水提物水溶液灌胃,空白对照组给予等量无菌动物饮用水。末次给药后颈动脉取血,分离血清,灭活后无菌超净台滤膜过滤,-70℃冰箱中保存备用。3.细胞培养及指标检测:取20和40代龄的人胚肺上皮成纤维细胞株(2bs细胞),分为:空白组、血清对照组、各药物组,连续干预培养4代后用于后期实验。取经处理后的各组细胞进行细胞周期及细胞凋亡测定,细胞上清检测抗氧化指标。4.统计学处理:本研究所获得数值型实验数据以SPSS12.0软件进行统计分析,所有试验数据均以(?)±s表示。对于正态分布且方差齐的资料,采用方差分析,多组样本之间的两两比较采用q检验。而对于非正态分布的资料采用秩和检验,多组样本之间两两比较采用基于秩次的M检验。检验水准α=0.05。实验结果1.通过对大枣,山药,地黄,金银花,菊花五种单方中药进行热水浸提,分别得到其水提物,对水提物进行成分检测分析,在五种水提物中,大枣水提物总糖含量最高(43.20±0.46),菊花水提物总糖含量最低(20.03±0.49)。对水提物总黄酮进行检测,金银花水提物总黄酮含量最高(15.63±0.35),地黄水提物总黄酮含量最低(1.97±0.25)。对五种水提物进行体外抗自由基能力测定,结果显示:水提物清除超氧阴离子自由基能力强弱顺序为:大枣＞地黄＞山药＞金银花＞菊花,且随着浓度的增加其清除率逐渐上升。2.五种山药水提物均能促进衰老细胞增殖;增加超氧化物歧化酶SOD的活性,降低脂质过氧化物MDA的含量,改善自由基代谢。大枣和山药水提物的作用最为明显,菊花水提物的作用最不明显。结论:1.各药物的水提物中均含有多糖、黄酮等众多生物活性物质,结合以往的研究资料提示,这些物质均具有抗氧化抗自由基的功能,且多种有效物质的协同作用效果明显。2.各药物的水提物对2bs细胞抗衰老作用的研究表明,各组水提物均具有抗氧化、清除自由基和增强机体抗自由基的能力,以大枣和山药水提物的作用最佳。结合第一部分的研究结果提示,水提物具有的抗氧化抗自由基能力与其所含的多糖及黄酮有关。

关键词：中药水提物 2bs细胞抗衰老

慢性纤维空洞型肺结核病人血清促2bs细胞增生的研究

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白求恩医科大学学报 1995年第5期21卷 517-518页

作者：马忠森赫国志孙立群成玉华朱平长春市结核病院

实验采用一组慢性纤维空洞型肺结核（简称慢纤洞肺结核）病人血清，观察了其对２ＢＳ细胞促增生的影响。结果证明，加病人血清２ＢＳ细胞培养组的ｃｐｍ值明显高于对照组，而且随着血清浓度的升高，ｃｐｍ值亦增高，增殖量从１．７４到... 详细信息

实验采用一组慢性纤维空洞型肺结核（简称慢纤洞肺结核）病人血清，观察了其对２ＢＳ细胞促增生的影响。结果证明，加病人血清２ＢＳ细胞培养组的ｃｐｍ值明显高于对照组，而且随着血清浓度的升高，ｃｐｍ值亦增高，增殖量从１．７４到９．９９倍。提示了慢纤洞肺结核病人血清中含有多种细胞因子，或以纤维化的形式痊愈，或以纤维化导致气体交换面积减少，最后导致呼吸功能衰竭。

关键词：慢性纤维空洞型肺结核 2bs细胞细胞因子

咖啡酸和迷迭香酸干预2bs细胞衰老作用及机制研究

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咖啡酸和迷迭香酸干预2BS细胞衰老作用及机制研究

疫苗生产用人二倍体细胞2bs和MRC-5中猪圆环病毒的检测

中国毒理学会第九次全国毒理学大会

作者：张可欣谢程亮谭剑斌曾杜娟黄鹭唐娇赵敏广东省疾病预防控制中心/广东省公共卫生研究院中山大学公共卫生学院广东药科大学

目的探索咖啡酸和迷迭香酸干预2bs细胞衰老作用及机制研究。方法:试验分为阴性对照组;800μmol·LHO模型组;2、5、10μg·mL咖啡酸组(同时含有800μmol·LHO与2、5、10μg·mL咖啡酸);5、10、25μg·mL迷迭香酸组(同时含有800μmol·LHO... 详细信息

目的探索咖啡酸和迷迭香酸干预2bs细胞衰老作用及机制研究。方法:试验分为阴性对照组;800μmol·LHO模型组;2、5、10μg·mL咖啡酸组(同时含有800μmol·LHO与2、5、10μg·mL咖啡酸);5、10、25μg·mL迷迭香酸组(同时含有800μmol·LHO与5、10、25μg·mL迷迭香酸),作用24h。体外DPPH自由基清除实验分为50、100、200、400、1000μmol·L咖啡酸与迷迭香酸剂量组。差异表达基因分析分为HO模型组,5μg·mL咖啡酸组,10μg·mL迷迭香酸组,作用24 h,提取各组细胞的总RNA,构建转录组文库,并通过BGISEQ-500平台进行测序,运用生物信息学方法对差异表达基因进行分析。检测指标:①细胞存活率;②衰老相关SA-β-gal染色;③细胞周期;④细胞凋亡;⑤抗氧化活性指标:细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、DPPH自由基清除实验测定体外抗氧化活性。⑥基于RNA-seq分析咖啡酸和迷迭香酸干预2bs细胞的分子机制研究。结果①与阴性对照组相比,HO模型组细胞存活率降低;SA-β-gal染色阳性率升高;G1期细胞比例升高,S期细胞与G2期细胞比例降低;活细胞比例降低,凋亡细胞比例升高;细胞内MDA含量升高,SOD含量降低。②与HO模型组相比,5μg·mL咖啡酸剂量组与5、10、25μg·mL迷迭香酸剂量组细胞存活率升高;各剂量组咖啡酸和迷迭香酸SA-β-gal染色阳性率降低,G1期细胞所占比例降低,S期细胞与G2期细胞所占比例升高;活细胞所占比例升高,凋亡细胞所占比例降低。③体外抗氧化实验显示,咖啡酸和迷迭香酸对DPPH的清除作用随着浓度的增加而增强;细胞内MDA含量降低,SOD含量升高。④咖啡酸筛选出WNT9、GSTM1目标基因及mTOR、Wnt信号通路,迷迭香酸筛选出cPLA2、IFNA1、GSTM1和CCR10目标基因及MAPK、Ras和PI3K/Akt信号通路作为后续研究目标。结论咖啡酸(5～10μg·mL)和迷迭香酸(5～25μg·mL)作用2bs细胞24 h,具有干预细胞衰老的作用。咖啡酸和迷迭香酸干预2bs细胞衰老的机制与其抗氧化活性相关,咖啡酸可能通过调控WNT9、GSTM1基因,迷迭香酸可能通过调控cPLA2、GSTM1、IFNA1和CCR10基因发挥其干预衰老的作用。

关键词：咖啡酸迷迭香酸衰老抗氧化 2bs细胞 H2O2

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国生物制品学杂志 2019年第7期32卷 732-734页

作者：刘欣玉黄艳秋李玉华中国食品药品检定研究院

目的检测疫苗生产用人二倍体细胞2bs和MRC-5是否存在外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)污染。方法对已建立的PCR方法进行灵敏度验证后,检测人二倍体细胞2bs和MRC-5中PCV1和PCV2污染情况。结... 详细信息

目的检测疫苗生产用人二倍体细胞2bs和MRC-5是否存在外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)污染。方法对已建立的PCR方法进行灵敏度验证后,检测人二倍体细胞2bs和MRC-5中PCV1和PCV2污染情况。结果两种细胞上清中最低均可检出1 pg的PCV1和PCV2 DNA,灵敏度较高;两种细胞中PCV检测结果均为阴性。结论在生产用人二倍体细胞2bs和MRC5中,均未检出PCV1和PCV2污染。

关键词：人二倍体细胞 2bs细胞 MRC-5细胞疫苗猪圆环病毒聚合酶链反应

衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第3期25卷 215-218页

作者：任文君王群义吕小凤毛泽斌蒋晓刚西安交通大学体育部生物医学信息工程教育部重点实验室陕西西安710049 西安市第二医院普外科陕西西安710003 北京大学医学部基础医学院生化系北京100083 西安交通大学医学院遗传与分子生物学系陕西西安710061

目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP-3基因的表达在年轻和衰老的2bs细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP-3上游包括5′-UTR区的2kb的序列并用酶切得... 详细信息

目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP-3基因的表达在年轻和衰老的2bs细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP-3上游包括5′-UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP-3启动子片段;将各片段用Effectene Transfection Reagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2bs细胞相比,衰老的2bs细胞中IGFBP-3基因的表达升高;在IG-FBP-3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5′-ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc-3′是IGFBP-3的增强子元件。结论:在衰老的2bs细胞中IGFBP-3基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件IEE(IGFBP-3enhancerelement),对IGFBP-3的表达起到调控作用。

关键词：胰岛素样生长因子结合蛋白-3 IEE(IGFBP-3 enhancerelement) 2bs细胞

胰岛素样生长因子结合蛋白3增强子元件(IEE)的生物学特征

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第20期13卷 3957-3961页

作者：任文君王群义吕小凤毛泽斌蒋晓刚生物医学信息工程教育部重点实验室西安交通大学生命科学与技术学院西安交通大学体育部陕西省西安市710049 西安市第二医院普外科陕西省西安市710003 北京大学医学部基础医学院生化系北京市100083 西安交通大学医学院遗传与分子生物学系陕西省西安市710061

背景:在细胞水平,胰岛素样生长因子结合蛋白3竞争性地与胰岛素样生长因子结合阻止了胰岛素样生长因子与其受体结合,从而抑制了胰岛素样生长因子的活性。目的:观察衰老细胞中调节性蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白3的生物学特征。设计、... 详细信息

背景:在细胞水平,胰岛素样生长因子结合蛋白3竞争性地与胰岛素样生长因子结合阻止了胰岛素样生长因子与其受体结合,从而抑制了胰岛素样生长因子的活性。目的:观察衰老细胞中调节性蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白3的生物学特征。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室完成。材料:人胚肺二倍体成纤维细胞(2bs)购于中国生物制品研究所。方法:用Northern的方法显示胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达在年轻和衰老的2bs细胞中存在差异;聚合酶链反应扩增出人类胰岛素样生长因子结合蛋白3上游包括5'-UTR区的2kb的序列,并用酶切得到4组不同长短的胰岛素样生长因子结合蛋白3启动子片段并确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件-IEE(IGFBP-3enhancer element)及其与蛋白结合的碱基序列等;用DNase I Footprinting法确定了IEE中与蛋白结合的核心序列。主要观察指标:①胰岛素样生长因子结合蛋白3基因在年轻和衰老细胞中的表达差异。②通过重叠寡核苷酸确定增强子元件。③通过凝胶阻滞试验证实该复合物结合活性与衰老相关的。④通过凝胶阻滞试验确定IEE与蛋白结合的碱基序列。⑤用DNase I Footprinting法确定IEE中与蛋白结合的核心序列。⑥判断与IEE结合蛋白的相对分子质量。结果:与年轻的2bs细胞相比,衰老的2bs细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达升高;5'-cca gcc tgc caa gca gcg tgc ccc ggt tgc-3'是胰岛素样生长因子结合蛋白3的增强子元件;该元件与蛋白结合的核心序列是CTG CCA和GCG TGC CCC G,而且这种结合是与衰老相关的;结合蛋白的相对分子质量大约在27000。结论:在2bs细胞中发现了一个新的转录增强子,它与蛋白结合的核心序列是CTG CCA和GCG TGC CCC G,可与一个大约27000的蛋白结合;在衰老细胞中可选择性地促进胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达。

关键词：胰岛素样生长因子结合蛋白3 IEE(IGFBP-3 enhancer element) 2bs细胞