检索结果-南通市图书馆

中国农业科学 2018年第13期51卷 2579-2591页

作者：许盈盈靳伟代敏敏樊宝良河北农业大学动物科技学院

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因(egfp)作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶(phytase)基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行... 详细信息

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因(egfp)作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶(phytase)基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2a序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因(egfp)为试验基因,红色荧光蛋白基因(dsred2)为内参基因。以p EGFP-N2、p GEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p EGFP-loxp(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区)、ploxp-EGFP-loxp(egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)。以p EGFP-N2质粒为对照质粒,以p Ds Red2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶(phytase基因)基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因(luciferase基因)为表达内参基因。以p IREs NEo、p GEM-5zf-loxp和p T-phytase、p GL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase(loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp(phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp(loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区)和p-SV40-luciferase-CMV-phytase(phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列)等试验质粒,以egfp基因(p EGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞,同时设置一个转p EGFP-N2+p Ds Red2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平(活性)进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因,对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著,表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响,转染前质粒的电泳结果表明,各质粒间不同构象的质粒比例基本一致,这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响,对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值(代表各转染的egfp基因表达水平)进行的统计分析表明,同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著,不同结构的转染间存在差异,其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于p EGFP-loxp和p EGFP-N2,而p EGFP-loxp和p EGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响,在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响,为了进一步验证上述结果的可靠性,本研究以植酸酶基因作为另一试验基因,以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因,以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证,验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2a序列连接,实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中,以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时,则内源基因的下游为最佳的打靶位点。

关键词： loxp序列基因表达 2a序列基因打靶

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口蹄疫病毒翻译起始区和2a关键位点对翻译起始及裂解效率的影响

口蹄疫病毒翻译起始区和2A关键位点对翻译起始及裂解效率的影响

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作者：高宗良中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)是感染偶蹄类动物的高度传染性疫病--口蹄疫的病原。其中FMDV内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）和2a序列编码的2a寡肽在FMDV多聚蛋白翻译起始和裂解成熟过程中... 详细信息

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)是感染偶蹄类动物的高度传染性疫病--口蹄疫的病原。其中FMDV内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）和2a序列编码的2a寡肽在FMDV多聚蛋白翻译起始和裂解成熟过程中发挥着重要作用。FMDV IRES3’端存在两个功能性起始密码子，可分别表达Lab、Lb产物。FMDV优先选择第二个AUG作为起始位点，对于该两个AUG的选择机制是近来研究的热点。2a裂解位点位于2a序列C-端的甘氨酸与脯氨酸之间，而此甘氨酸的使用非常保守，因此该甘氨酸在2a序列中是非常重要的。本研究以FMDV IRES元件3’端两个功能性起始密码子周围序列和2a序列为研究对象，利用生物信息学技术对96条不同血清型的FMDV基因组序列中IRES元件下游两个具有翻译起始功能的AUG核苷酸三联体所处于的翻译起始序列环境和2a序列的密码子使用模式分别进行了分析。研究发现，FMDV的两个AUG所处的核苷酸环境具有明显的差异性，并且根据第一个、第二个AUG环境分别确定了劣势、优势翻译起始序列（-TTTATGAAC-和-AAGATGGAA-）。利用生物信息学技术建立数学公式，对66条不同血清型FMDV所具有的2a序列进行综合性研究，发现2a序列3’端甘氨酸密码子使用模式十分保守，基本都使用GGG作为编码甘氨酸的密码子。在生物信息学预测的基础上，分别构建了包含IRES对应的两种特定翻译起始序列和2a序列C-端甘氨酸对应的四种同义密码子（GGA、GGT、GGC和GGG）的双报告基因（氯霉素乙酰转移酶基因和增强型绿色荧光基因）表达系统。运用脂质体转染方法将重组质粒导入CHO细胞，提取细胞RNA进行反转录反应，在mRNA水平证明了构建的重组载体的正确表达,并在不同时间段通过荧光显微镜观察表达情况。最后将细胞回收进行蛋白质印迹的检测，在翻译水平通过对两种报告基因进行表达量的检测，从而分析不同翻译起始序列对翻译效率的影响及2a序列C-端甘氨酸不同同义密码子的替换对2a裂解效率的影响。 West-blotting结果显示，IRES介导的优势翻译起始序列对下游增强型绿色荧光蛋白的翻译起始效率明显高于劣势翻译起始序列。在转染后12、16、20、24、36h，优势翻译起始序列引导的增强型荧光蛋白的表达量分别是是劣势翻译起始序列的7.3、4.45、3.16、2.3、1.63倍。这说明FMDV优先选择第二个AUG作为起始位点与功能性AUG所处的核苷酸环境有关。此外，2a序列C-端甘氨酸四种同义密码子所介导的2a寡胎自动裂解效是不同的，其中GGG（94%）、GGC(93.2%）、GGA(91.5%)要大于GGT(86.8%)（0.012a序列C-端的甘氨酸。这为进一步探讨FMDV宿主细胞内的翻译方式和控制病毒的翻译复制提供新的理论基础。

关键词：口蹄疫病毒翻译起始区 2a序列密码子使用翻译

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