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携带小鼠RORγt基因慢病毒载体的构建及其在293ft细胞中的表达

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中国实验血液学杂志 2010年第6期18卷 1600-1603页

作者：陈翀张焕新曾令宇张滢张建军徐开林徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002 徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293ft细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208... 详细信息

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293ft细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208,生成pXZ9-RORγt。用脂质体介导三质粒共转染法转染293ft细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,以Western blot鉴定RORγt的表达。结果表明,RT-PCR扩增出RORγt基因并克隆入PCR2.1T载体;经亚克隆构建了慢病毒转移质粒XZ9-RORγt。质粒经脂质体转染293ft细胞获慢病毒颗粒,慢病毒颗粒体外高效感染293ft细胞,感染后Western blot检测到RORγt蛋白表达。结论:成功构建慢病毒载体pXZ9-RORγt,并在293细胞内获得表达。

关键词：慢病毒载体 RORγt 293ft细胞

PEX慢病毒载体构建及其在293ft细胞中的分泌表达

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医学分子生物学杂志 2010年第6期7卷 488-492页

作者：赵中松赵敬湘张韶峰王字玲唐红卫李锦毅辽宁医学院研究生学院辽宁省锦州市121001 军事医学科学院野战输血研究所北京市100850 武警总医院临床教研室北京市100039

目的构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293ft细胞中分泌表达PEX蛋白.方法利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒（pLP1、pLP... 详细信息

目的构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293ft细胞中分泌表达PEX蛋白.方法利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒（pLP1、pLP2）、包膜质粒（pLP/VSVG）共转染293ft细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3＂细胞后,Western印迹法检测293FI＂细胞培养上清中PEX的表达.结果酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293ft细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293ft细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293ft细胞并持续分泌表达目的蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.

关键词： PEX基因信号肽慢病毒载体 293ft细胞

真核表达人Wnt7b基因建立软骨细胞退变模型

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南方医科大学学报 2015年第3期35卷 370-374页

作者：王小军张浩郑杰庞坚曹月龙詹红生丁道芳浙江中医药大学附属湖州市中医院浙江湖州313000 上海吉凯基因化学技术有限公司上海201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心上海201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所上海201203

目的在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24 h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b基因及克隆至PCDH-GFP上,转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b... 详细信息

目的在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24 h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b基因及克隆至PCDH-GFP上,转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b至293ft细胞中,48 h后收集细胞上清及转染细胞,Western blot鉴定Wnt7b在293ft细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞,24 h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA,Western blot和定量PCR检测软骨退变指标MMP13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、ColⅩ和SOX9的表达。结果成功克隆人Wnt7b基因至PCDH-GFP载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含Wnt7b培养基干预软骨细胞24 h后,软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形,Wnt7b处理组软骨细胞MMP13和MMP3表达显著上调,Ⅱ型胶原的表达下调。PCR结果表明A-can和Sox9表达下降,ColⅩ和ADAMTS5表达增强。结论有效在真核细胞中表达Wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变,建立软骨细胞退变的体外模型。

关键词： Wnt7b基因 293ft细胞软骨细胞转染细胞退变

稳定表达新抑癌基因WTX的胃癌BGC-823/WTX-EGFP细胞株的建立

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南方医科大学学报 2011年第3期31卷 392-396页

作者：陈可绪王啓名黄怡哲吴焕张庆玲南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东广州510515

目的构建含有全长WTX(Wilms tumor gene on the X chromosome)目的基因的表达载体,建立稳定表达WTX基因的胃癌BGC-823/WTX-EGFP细胞系,为WTX基因功能研究提供保障。方法以人胚肾293ft细胞为模板,经PCR扩增获得全长WTX cDNA序列,将全长WT... 详细信息

目的构建含有全长WTX(Wilms tumor gene on the X chromosome)目的基因的表达载体,建立稳定表达WTX基因的胃癌BGC-823/WTX-EGFP细胞系,为WTX基因功能研究提供保障。方法以人胚肾293ft细胞为模板,经PCR扩增获得全长WTX cDNA序列,将全长WTX目的基因序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-N1表达载体,建立pEGFP-WTX表达载体。经限制性内切酶酶切鉴定、测序并转染293ft细胞观察报告基因表达情况,判断pEGFP-WTX表达载体构建是否成功。构建成功的pEGFP-WTX表达载体转染人胃癌BGC-823细胞,建立稳定表达WTX的BGC-823/WTX-EGFP细胞。qRT-PCR及免疫组化检测转染细胞WTX表达。结果 PCR方法从人胚肾293ft细胞扩增获得全长WTX cDNA,经测序鉴定序列完全正确;pEGFP-WTX质粒DNA经酶切鉴定片段大小正确、转染294ft细胞可见清晰的绿色荧光表达。BGC-823/WTX-EGFP细胞能够稳定表达WTX。结论本研究成功构建了含有全长WTX cDNA的表达载体系统,建立了稳定表达WTX的BGC-823/WTX-EGFP细胞,为WTX基因功能研究奠定了良好基础。

关键词： WTX 293ft细胞载体构建

稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞株的建立及其肿瘤相关基因的研究基因

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南方医科大学学报 2012年第3期32卷 312-316页

作者：王妮娜谢剑明郑大勇左强廖旺军南方医科大学南方医院肿瘤科广东广州510515

目的构建含有全长肠癌转移相关基因(MACC1)的表达载体,建立稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞系,通过基因芯片技术筛选出转染MACC1后胃癌细胞株的差异表达基因,探讨MACC1基因与差异基因之间可能的调节机制或信号通路。... 详细信息

目的构建含有全长肠癌转移相关基因(MACC1)的表达载体,建立稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞系,通过基因芯片技术筛选出转染MACC1后胃癌细胞株的差异表达基因,探讨MACC1基因与差异基因之间可能的调节机制或信号通路。方法以人胚肾293ft细胞为模板,经PCR扩增获全长MACC1 cDNA序列,将目的基因序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的pBaBb-puro表达载体,建立pBaBb-puro-MACC1表达载体。经限制性内切酶酶切鉴定、测序并转染293ft细胞观察报告基因表达情况判断是否构建成功。构建成功后的pBaBb-puro-MACC1表达载体转染人胃癌BGC-823细胞,建立稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞。qRT-PCR及western blot检测转染细胞的MACC1基因表达,应用基因芯片技术筛选出转染MACC1基因后胃癌细胞株的差异表达基因并对其探讨研究。结果成功扩增全长MACC1cDNA,经测序鉴定序列完全正确;转染293ft细胞可见清晰的绿色荧光表达。BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞能够稳定表达MACC1。基因芯片筛选出差异基因发现上调基因33个,下调基因24个,这些差异表达基因的功能涉及多个方面。结论成功构建了含有全长MACC1cDNA的表达载体系统,建立了稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞,通过对差异基因的分析发现MACC1可能引起胃癌细胞株BGC-823基因表达谱中一些非常重要的分子的改变,为MACC1基因进一步研究奠定了良好基础。

关键词： MACC1 293ft细胞载体构建基因芯片

埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

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中国生物工程杂志 2016年第12期36卷 66-71页

作者：孙鹏艳黎奎刘存宝姚宇峰褚晓杰白红妹杨旭黄惟巍孙文佳马雁冰昆明医科大学昆明650500 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法:根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分... 详细信息

目的:制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法:根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293ft细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果:构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论:在293ft细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。

关键词：埃博拉病毒病毒样颗粒 293ft细胞表达

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

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中国组织工程研究 2013年第23期17卷 4272-4278页

作者：杜晶春朱蕊范婷婷王鹏鲲林勇平徐霞广州医学院第一临床学院检验系广东省广州市510182 广州医学院第一附属医院妇产科广东省广州市510120

背景:以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。目的:利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞,以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。方法:首... 详细信息

背景:以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。目的:利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞,以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。方法:首先利用多位点Gateway技术构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,将该表达载体与慢病毒包装质粒同时转染293ft细胞,从而获得携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒颗粒。利用重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞,并通过抗生素筛选的方法获得稳定表达目的基因-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的羊水间充质干细胞,并对其稳定性进行鉴定。结果与结论:酶联免疫吸附法和Westernblot检测结果表明,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在感染的人羊水间充质干细胞内呈高表达,其表达量可达到72μg/L。说明实验成功制备了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞。

关键词：干细胞干细胞培养与分化人羊水间充质干细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因修饰慢病毒载体多位点稳定表达目的基因 293ft细胞组织工程国家自然科学基金干细胞图片文章

CCL20基因短发夹RNA表达载体转染人胚胎肾细胞的干扰效应

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免疫学杂志 2009年第6期25卷 642-645页

作者：何升东彭代智何斌刘敬周新王勇王丽华郑必祥左海斌第三军医大学西南医院全军烧伤研究所

目的观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293ft细胞),以及对其表达CCL20 mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用。方法用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和... 详细信息

目的观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293ft细胞),以及对其表达CCL20 mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用。方法用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和pSCS-EGFP-3均为CCL20基因特异型)转染到293ft细胞,24h后分别用荧光显微镜照相和流式细胞仪检测293ft细胞的转染率。将未转染及分别转染3种质粒的293ft细胞培养48h,用TNF-α和IL-1β刺激培养24h后,分别用荧光定量RT-PCR和ELISA法检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,计算其抑制率。结果3种质粒(pSCS-EG-FP-1～3)转染293ft细胞的效率分别为(73.8±5.3)%、(50.0±4.8)%、(56.8±2.9)%。加细胞因子刺激下,3种载体对293ft细胞表达CCL20 mRNA相应的抑制率分别为(18.53±34.44)%、(90.40±3.94)%和(92.50±6.15)%;上清中CCL20蛋白相应的抑制率分别为(14.88±17.39)%、(71.76±8.27)%和(88.56±1.74)%。未加细胞因子刺激下,CCL20 mRNA的相应抑制率分别为(61.37±11.72)%、(84.33±12.78)%和(80.27±15.84)%;CCL20蛋白的相应抑制率分别为(19.91±48.12)%、(-27.87±50.24)%和(87.21±8.36)%。结论特异性CCL20shRNA表达载体能明显下调细胞因子刺激人胚胎肾细胞表达CCL20 mRNA及蛋白,该载体为研究肾移植排斥反应等CCL20相关性肾脏疾病的治疗提供了一定的实验基础。

关键词： CCL20 RNA干扰短发夹RNA 293ft细胞

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

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中国实验血液学杂志 2012年第1期20卷 168-172页

作者：陈伟陈翀张焕新闫志凌程海曾令宇徐开林徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002 南京医科大学江苏南京210029

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c... 详细信息

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293ft,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293ft细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293ft细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293ft细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293ft细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。

关键词：成纤维细胞生长因子受体基因慢病毒载体构建基因表达 293ft细胞