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The application of 2-nbdg as a fluorescent tracer for assessing hepatic glucose production in mice during hyperinsulinemic euglycemic clamp

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2012年第4期2卷 403-410页

作者： Shuainan Liu Quan Liu Sujuan Sun Qian Jiang Jun Peng Zhufang Shen State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines Institute of Materia MedicaChinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeDiabetes Research Center of Chinese Academy of Medical SciencesBeijing 100050China

Methods of performing insulin clamps vary between *** we present a protocol of insulin clamping in conscious mice,with the significant advantage of avoiding multiple surgical catheterizations and non-physiologic metabolism during the induction of *** this technique we also established a new method for measuring hepa tic glucose production(HGP)using a fuorescent D-glucose analog,2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyglu-cose(2-nbdg).To prove the reliability and feasibility of this method,whole-body insulin sensitivity was compared between conscious normal ICR mice and diabetic KK^(Ay) mice using the insulin *** and clamp HGP was compared between normal C57 mice and diabetic db/db mice by using the modified clamp with 2-nbdg as a *** glucose infusion rate(GIR),an index of insulin sensitivity,was significantly lower in KKAy mice than normal ICR mice.(6.2±1.3 mg/kg/min vs.31.3±2.9 mg/kg/min,P25.8±2.2 mg/kg/min vs.16.7±2.5 mg/kg/min,P2.8 mg/kg/min vs.15.2±1.6 mg/kg/min,P2-nbdg,rather than isotopic tracers,for the determination of HGP in vivo.

关键词： Conscious mice Hyperinsulinemic euglycemic clamp 2-nbdg Hepatic glucose production

2-nbdg用于乳腺癌MDA-MB-231细胞荧光检测研究

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江苏大学学报（医学版） 2010年第3期20卷 216-219页

作者：胡慧单秀红朱伟钱晖许文荣王亚非江苏大学临床医学院江苏镇江212001 江苏大学附属人民医院影像科江苏镇江212002 江苏大学基础医学与医学技术学院江苏镇江212013

目的:评价荧光2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基](2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino],NBD)标记2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)即2-nbdg,靶向探测高表达葡萄糖转运蛋白1(Glut1)的MDA-MB-231乳腺癌细胞可行性。方法:2-nbdg分别孵育接种在6孔板里的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1,10,20,40 min后,荧光显微镜观察并摄像;为了进行竞争性抑制,用D型葡萄糖预先孵育细胞30 min后再加入2-nbdg孵育20 min,荧光显微镜观察并摄像。同时用流式细胞仪分析孵育不同时间及有无竞争抑制的细胞吸收2-nbdg量的差异。结果:荧光成像显示2-nbdg积聚在MDA-MB-231细胞膜和细胞质内,加入D型葡萄糖竞争抑制后,荧光信号显著减弱;流式细胞仪分析表明最初的1 min 2-nbdg被肿瘤细胞迅速摄取(MDA-MB-231细胞自发荧光强度为2.66±0.09,2-NB-DG孵育1 min后荧光强度为4.04±0.18),10 min时吸收持续增加(荧光强度为5.64±0.17),20 min吸收最明显(荧光强度为25.10±0.57);加入D型葡萄糖竞争抑制后,细胞摄取2-nbdg的荧光强度降低46%。结论:2-nbdg能迅速被高表达Glut1的MDA-MB-231乳腺癌细胞靶向吸收,有望成为葡萄糖代谢的光学标记物来检测高代谢的恶性肿瘤。

关键词：乳腺癌细胞 2-nbdg 荧光成像流式细胞仪

黑曲霉葡萄糖吸收定量检测的方法建立及其在MstC功能研究中的应用

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生物技术通报 2023年第12期39卷 71-80页

作者：高凯月郭雨婷杜奕谋郑小梅马欣荣赵伟郑平孙际宾天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308 中国科学院大学北京100049 山东福洋生物科技股份有限公司德州253100

黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成。作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发... 详细信息

黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成。作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能。针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题,本文以2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-nbdg)作为葡萄糖吸收探针,通过将预培养的黑曲霉孢子与2-nbdg孵育后,利用荧光显微成像与流式细胞分析,建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法。结果发现,2-nbdg的最佳使用浓度为150μmol/L,最佳孵育时间为4 h。进一步利用该定量分析方法,发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高1.44倍,同时在前期研究的基础上,利用多序列比对分析,设计了MstC的突变体R188K,通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失,这表明Arg188是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点。本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用,不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识,也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑。

关键词：黑曲霉葡萄糖吸收 2-nbdg 葡萄糖转运蛋白 MstC 荧光成像流式细胞检测

A Fluorescent Glucose Transport Assay for Screening SGLT2 Inhibitors in Endogenous SGLT2-Expressing HK-2 Cells

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Natural Products and Bioprospecting 2019年第1期9卷 13-21页

作者： Yan-Ting Lu Xiu-Li Ma Yu-Hui Xu Jing Hu Fang Wang Wan-Ying Qin Wen-Yong Xiong State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China Kunming Institute of BotanyChinese Academy of SciencesKunming 650201China University of the Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Yunnan Key Laboratory of Natural Medicinal Chemistry Kunming 650201China

The sodium-dependent glucose transporters 2(SGLT2)plays important role in renal reabsorption of urinal glucose back to plasma for maintaining glucose *** approval of SGLT2 inhibitors for treatment of type 2 diabetes highlights the SGLT2 as a feasible and promising drug target in recent *** methods for screening SGLT2 inhibitors are complex,expensive and labor ***,these methods cannot directly measure nonradioactive glucose uptake in endogenous SGLT2-expressing kidney *** present work,human kidney cells,HK-2,was incubated with a fluorescent D-glucose derivant 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose(2-nbdg)and the fluorescent intensity of 2-nbdg was employed to measure the amount of glucose uptake into the *** optimizing the passages of HK-2 cells,2-nbdg concentration and incubation time,and by measuring glucose uptake treated by Dapagliflozin,a clinical drug of SGLT2 inhibitors,we successfully developed a new assay for measuring glucose uptake through *** nonradioactive microplate and microscope-based high-throughput screening assay for measuring glucose can be a new method for screening of SGLT2 inhibitors and implied for other cell assays for glucose measurement extensively.

关键词： SGLT2 inhibitor 2-nbdg HK-2 Glucoseuptake

紫色悬钩子提取物对TNF-α诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的影响

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今日药学 2022年第4期32卷 257-263页

作者：刘悦余松韩永霞铁芳芳童丽杨芳青海大学医学院青海西宁810016 中国科学院西北高原生物研究所青海西宁810008 青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室青海西宁810001

目的利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导培养建立及鉴定3T3-L1脂肪细胞胰.岛素抵抗模型,探讨紫色悬钩子提取物对胰岛素抵抗的影响。方法采用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松(Dex)、胰.岛素联合诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂... 详细信息

目的利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导培养建立及鉴定3T3-L1脂肪细胞胰.岛素抵抗模型,探讨紫色悬钩子提取物对胰岛素抵抗的影响。方法采用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松(Dex)、胰.岛素联合诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,分别与0,2,5,10,15,20 ng·mL^(-1)TNF-α共孵育24,48,72,96 h;MTT法检测紫色悬钩子提取物和TNF-α对3T3-L1脂肪细胞活力的影响;油红O染色观察细胞形态的变化;Western Blot检测Akt、p-Akt蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞对2-nbdg的摄取。结果TNF-α浓度大于等于10 ng·mL^(-1),诱导时间大于等于72 h能够显著降低胰岛素刺激后p-Akt的表达(P2-nbdg的摄取能力,其中Fr.3作用最显著(P<0.05).结论TNF-α诱导培养可以成功建立胰岛素抵抗细胞模型,紫色悬钩子提取物具有改善胰岛素抵抗的作用。

关键词：紫色悬钩子 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型肿瘤坏死因子-α 2-nbdg

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泽泻醇A对体外葡萄糖吸收的影响

中国民族民间医药 2023年第20期32卷 20-23页

作者：林燕玲洪铃冰丘志龙王晨炜蔡增宏杨晓烨曾敏洁张伟云厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室福建厦门361023 福建医科大学药学院福建福州350122

目的:探讨泽泻醇A对人肝癌细胞(HepG2细胞)葡萄糖吸收活性的影响。方法:使用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)测定HepG2细胞活力,利用2-nbdg(2-Deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose)法测定细胞对葡萄糖的吸收能力,采用不同培养基培养HepG2细胞,通过流式细胞仪检测细胞荧光强度,从而考察不同浓度的泽泻醇A对HepG2细胞葡萄糖吸收的影响。结果:CCK-8实验结果表明,在1~10μmol/L范围内,泽泻醇A对HepG2细胞活力无明显影响。糖吸收实验结果表明泽泻醇A在不同程度上具有促进HepG2细胞对葡萄糖吸收的能力。结论:泽泻醇A可在一定程度上促进HepG2细胞对葡萄糖的吸收,提示泽泻醇A可能为泽泻降血糖的活性成分之一。

关键词：泽泻醇A HepG2细胞 CCK-8 2-nbdg 葡萄糖吸收

苯丙氨酸对C2C12细胞葡萄糖摄取能力的影响及与mTOR-p70S6K通路的关系探讨

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四川大学学报（医学版） 2018年第3期49卷 369-373页

作者：杜蓉杜涓田浩明陈涛高赟龙洋刘丹四川大学华西医院内分泌代谢科成都610041 西南医科大学附属医院泸州646000

目的观察苯丙氨酸对小鼠成肌细胞系C2C12葡萄糖摄取能力的影响,以及刺激后细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70S6K信号通路分子的变化。方法体外培养C2C12细胞,分化诱导为多核的肌管细胞后进行饥饿处理,然后分别用不同浓度苯丙氨酸(... 详细信息

目的观察苯丙氨酸对小鼠成肌细胞系C2C12葡萄糖摄取能力的影响,以及刺激后细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70S6K信号通路分子的变化。方法体外培养C2C12细胞,分化诱导为多核的肌管细胞后进行饥饿处理,然后分别用不同浓度苯丙氨酸(1.25、2.5、5、10、20mmol/L)处理细胞,以KRB平衡液作为对照。通过检测2-nbdg评价细胞葡萄糖摄取能力。用Western blot方法检测细胞内mTOR、p70S6K、胰岛素受体底物(IRS)-1、蛋白激酶B(Akt)的表达情况。结果与KRB平衡液对照相比,5mmol/L亮氨酸使C2C12细胞的葡萄糖摄取能力下降了约30%(P=0.001),5mmol/L苯丙氨酸使C2C12细胞摄取葡萄糖的能力上升了约40%(P2448磷酸化水平无明显影响。除1.25mmol/L外,其它浓度苯丙氨酸均能抑制p70S6K Thr389的表达。亮氨酸使IRS-1Ser636/639磷酸化水平表达增高(P25mmol/L外,其它浓度的苯丙氨酸均有抑制IRS-1Ser636/639表达的趋势,但与对照相比差异无统计学意义(P=0.381)。高浓度短时间的苯丙氨酸刺激对C2C12细胞内的Akt Ser473表达无明显影响。结论苯丙氨酸可能通过减少p70S6K的磷酸化,继而减少p70S6K对IRS-1的刺激作用而使细胞葡萄糖摄取能力增强。但苯丙氨酸对mTOR-p70S6K通路的抑制作用不通过Akt的激活。

关键词：苯丙氨酸胰岛素抵抗 mTOR-p70S6K 2-nbdg C2C12细胞

胰岛素激活PI_3K-AKT通路而促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取

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第三军医大学学报 2015年第6期37卷 538-542页

作者：叶林陆凯张冬颖覃数重庆医科大学附属第一医院重症医学科重庆400016 重庆医科大学附属第一医院心血管内科重庆400016

目的探索胰岛素(Insulin)对H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的影响及其与PI3K-AKT信号通路的关系。方法采用不同时间及不同浓度的胰岛素处理H9c2心肌细胞,确定胰岛素处理H9c2细胞的最佳浓度和最适时间。实验分空白对照组(NC组),2-nbdg组,Insulin... 详细信息

目的探索胰岛素(Insulin)对H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的影响及其与PI3K-AKT信号通路的关系。方法采用不同时间及不同浓度的胰岛素处理H9c2心肌细胞,确定胰岛素处理H9c2细胞的最佳浓度和最适时间。实验分空白对照组(NC组),2-nbdg组,Insulin组,Insulin+PI3K-AKT通路抑制剂LY294002组(LY294002组),Insulin+p38MAPK通路抑制剂BIRB796组(BIRB796组),使用荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-nbdg)检测H9c2心肌细胞葡萄糖摄取能力,以流式细胞仪和荧光酶标仪检测心肌细胞对葡萄糖摄取的变化。通过间接免疫荧光法及激光共聚焦检测H9c2心肌细胞葡萄糖转运体-1(glucose tansporter-1,GLUT-1)及葡萄糖转运体-4(glucose tansporter-4,GLUT-4)的表达。结果 12-nbdg可用于检测H9c2心肌细胞葡萄糖摄取能力。2Insulin处理H9c2心肌细胞最适浓度和时间分别为200μmol/L和30 min。3Insulin组与对照组相比增加H9c2心肌细胞葡萄糖摄取(P294002组与Insulin组相比降低心肌细胞葡萄糖摄取,两组间差异明显(P0.05),提示LY294002可抑制Insulin促进心肌细胞葡萄糖摄取,而BIRB796不能抑制上述作用。4 H9c2心肌细胞膜表达葡萄糖转运体1(GLUT1)和葡萄糖转运体4(GLUT4),Insulin处理H9c2心肌细胞30min后经激光共聚焦成像显示H9c2心肌细胞膜GLUT1和GLUT4表达增加(P2心肌细胞葡萄糖摄取的作用可能与PI3K-AKT通路相关,与p38MAPK通路不相关,胰岛素激活PI3K-AKT信号通路后可能促进H9c2心肌细胞膜上GLUT-1及GLUT-4的表达,从而使H9c2心肌细胞对葡萄糖摄取增加。

关键词：胰岛素 2-nbdg H9c2心肌细胞葡萄糖摄取 PI3K-AKT p38MAPK GLUT1和GLUT4

代综方对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取及GLUT4蛋白表达的影响

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重庆医科大学学报 2017年第11期42卷 1494-1497页

作者：赵玉雪朱晓云袁泉刘喜明中国中医科学院广安门医院内分泌科北京100053

目的:研究代综方(dai zong fang,DZF)对骨骼肌细胞葡萄糖摄取及葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达的影响。方法:采用含2%马血清(horse serum,HS)的DMEM培养液诱导C2C12骨骼肌细胞分化为肌管,荧光标记的葡萄糖类似物2-... 详细信息

目的:研究代综方(dai zong fang,DZF)对骨骼肌细胞葡萄糖摄取及葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达的影响。方法:采用含2%马血清(horse serum,HS)的DMEM培养液诱导C2C12骨骼肌细胞分化为肌管,荧光标记的葡萄糖类似物2-nbdg测定葡萄糖摄取,对2-nbdg的量效时效关系进行测定;采用不同剂量DZF干预分化的C2C12细胞,检测其对细胞基础状态及胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响;Western blot检测DZF对C2C12细胞GLUT4总蛋白表达及膜转位的影响。结果:在基础状态或胰岛素刺激下,DZF低、中、高剂量均可提高骨骼肌葡萄糖摄取,差异有统计学意义(P0.05),但仍可促进GLUT4膜转位蛋白的表达(P<0.05)。结论:DZF可增加骨骼肌细胞葡萄糖摄取,具有类胰岛素作用,其作用机制可能与促进GLUT4蛋白向细胞膜转位有关。

关键词：代综方 2-nbdg C2C12细胞葡萄糖转运体4