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PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在小鼠肺纤维化过程中的作用研究

PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在小鼠肺纤维化过程中的作用研究

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作者：李颖迪华北理工大学

学位级别：硕士

目的采用C57BL/6小鼠进行动物实验,在验证本课题组前期研究结果的基础上,探讨PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在不同因素所致肺纤维化发生发展过程中的作用及其机制,为探索肺纤维化的精准治疗方案奠定理论基础。方法使用浓度200 mg/m L... 详细信息

目的采用C57BL/6小鼠进行动物实验,在验证本课题组前期研究结果的基础上,探讨PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在不同因素所致肺纤维化发生发展过程中的作用及其机制,为探索肺纤维化的精准治疗方案奠定理论基础。方法使用浓度200 mg/m L二氧化硅(Si O2)悬浊液、剂量为4 mg/kg博来霉素(BLM)构建矽肺模型和特发性肺纤维化模型。使用PI3K抑制剂(LY294002)、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-me2)进行干预。72只小鼠随机分配至各组,每组6只。Si O2实验组包括6组,分别是对照组、模型组、LY294002早期/晚期干预组、2-me2早期/晚期干预组。BLM实验组分为6组,分别是对照组、模型组、LY294002早期/晚期干预组、2-me2早期/晚期干预组,共12组。早期干预组造模第2天开始;BLM晚期抑制剂干预组从第22天开始,Si O2晚期抑制剂干预组从第29天开始。BLM实验组持续42天;Si O2实验组持续56天。HE和VG染色检测肺组织病理变化。免疫组化与Western blot检测肺组织中通路指标磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达水平。Western blot法检测肺组织中糖酵解关键酶己糖激酶1(HK1)、乳酸脱氢酶(LDHA)蛋白表达水平。试剂盒检测血清中糖酵解关键酶丙酮酸激酶(PK)活性及代谢产物丙酮酸、乳酸(LD)含量。免疫组化检测肺组织中炎症因子白介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。免疫组化检测肺组织中Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ),试剂盒检测羟脯氨酸(HYP)含量。结果***造模实验:各组实验小鼠一般情况、脏器系数及肺功能无明显差异。HE与VG染色结果显示,BLM模型组的肺组织结构严重破坏、大量炎症细胞浸润及胶原沉积。给予LY294002、2-me2后肺组织结构破坏程度下降、炎症细胞浸润及胶原沉积减少。免疫组化、Western blot和试剂盒检测结果显示,与对照组相比,模型组信号通路相关因子PI3K、p-AKT及HIF-1α表达水平明显升高;糖酵解关键酶LDHA、PK和糖酵解代谢产物LD、丙酮酸的含量明显升高;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量明显上升。给予LY294002、2-me2后,与模型组相比,PI3K、p-AKT及HIF-1α表达水平都存在不同程度降低;糖酵解关键酶LDHA、PK和糖酵解代谢产物LD、丙酮酸的含量都存在不同程度降低;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量都存在不同程度下降。早期抑制剂干预对糖酵解因子、炎症因子以及纤维化因子的影响效果比晚期抑制剂更明显。说明PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在博来霉素所致肺纤维化的发生发展过程中起到影响糖代谢方式、炎症情况及肺组织纤维化进程的作用。*** O2造模实验:各组实验小鼠一般情况、脏器系数及肺功能无明显差异。HE与VG染色结果显示,Si O2模型组的肺组织结构严重破坏并逐渐结节、大量炎症细胞浸润及胶原沉积。给予LY294002、2-me2后肺组织结构破坏程度下降、炎症细胞浸润及胶原沉积减少。免疫组化、Western blot和试剂盒检测结果显示,与对照组相比,模型组信号通路相关因子PI3K、p-AKT及HIF-1α表达水平明显升高;糖酵解关键酶HK1、LDHA、PK和糖酵解代谢产物LD含量明显升高;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量明显上升。给予LY294002、2-me2后,与模型组相比,各组小鼠肺组织中PI3K、p-AKT及HIF-1α表达水平都存在不同程度降低;糖酵解关键酶HK1、LDHA、PK和糖酵解代谢产物LD的含量都存在不同程度降低;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量都存在不同程度下降。早期抑制剂干预对糖酵解因子、炎症因子以及纤维化因子的影响效果比晚期抑制剂更明显。说明PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在二氧化硅所致肺纤维化的发生发展过程中起到影响糖代谢方式、炎症情况及肺组织纤维化进程的作用。3.上述特发性肺纤维化和矽肺两种模型的实验结果显示,抑制PI3K/AKT/HIF-1α信号通路,都能够改善糖酵解、炎症和肺纤维化的情况。不同的是抑制该信号通路后,对糖酵解、炎症和肺纤维化产生影响的因子和程度有所不同,这可能与BLM和Si O2所引起的肺纤维化机制有所不同。上述研究结果为研究BLM和Si O2致肺纤维化的发病机制提供了新的思路和科学依据。结论PI3K/AKT/HIF-1α糖酵解信号通路在肺纤维化过程中起到了调控枢纽作用,抑制该通路关键因子的表达可以减缓BLM和Si O2所诱导的小鼠肺纤维化进程。图30幅;表14个

关键词： PI3K/AKT/HIF-1α LY294002 2-me2 肺纤维化糖酵解

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氯化钴在BMSCs修复HIBD认知功能中的作用

氯化钴在BMSCs修复HIBD认知功能中的作用

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作者：李文迪重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分建立CoCl激活BMSCs的HIF-1信号系统的最佳药物浓度及HIF-1抑制剂2-me2在BMSCs分泌效应中的作用目的建立氯化钴(CoCl)药物浓度水平与BMSCs的HIF-1蛋白水平、增殖指标MTS以及损伤指标LDH水平的效应曲线。以VEGF、EPO、IGF-1蛋白... 详细信息

第一部分建立CoCl激活BMSCs的HIF-1信号系统的最佳药物浓度及HIF-1抑制剂2-me2在BMSCs分泌效应中的作用目的建立氯化钴(CoCl)药物浓度水平与BMSCs的HIF-1蛋白水平、增殖指标MTS以及损伤指标LDH水平的效应曲线。以VEGF、EPO、IGF-1蛋白水平为效应指标，论证HIF-1稳定剂及HIF-1抑制剂2-me2在BMSCs分泌效应中的作用，并确定BMSCs分泌蛋白的时间剂量曲线。寻求CoCl激活BMSCs的HIF-1a信号系统的最佳药物浓度。1 方法分离培养BMSCs并用0、10、25、50、100M CoCl干预12h、24h、36h、48h后采用LDH检测BMSCs毒性和MTS检测BMSCs增殖情况;采用ELISA检测CoCl及HIF-1抑制剂2-me2在BMSCs分泌VEGF、EPO、IGF-1中的作用;采用westernblot检测25M CoCl干预BMSCs6h、12h、24h、36h后HIF-1蛋白的表达趋势。结果(1)LDH检测结果显示不同药物浓度的CoCl在0-48h之间对细胞毒性影响无统计学意义(p>0.05)。(2)MTS检测结果显示不同药物浓度的CoCl在0-48h之间对细胞增殖的影响无统计学意义(p>0.05)。(3)CoCl作用BMSCs后，分泌蛋白的时间剂量效应关系：10M CoCl在48h内不能有效促进BMSCs分泌VEGF，25MCoCl在36h内随着作用时间的增加VEGF表达也增多，36h表达量最多;在12h时，随着剂量的增加EPO蛋白表达增加，100M达到最大;各药物浓度在作用BMSCs12h、36h、48h后，IGF-1蛋白的表达与对照组比较无明显的差异(p>0.05)。(4)CoCl作用BMSCs后，westernblot检测HIF-1蛋白表达的时间效应，36h HIF-1蛋白表达比其它各组都多(p25M CoCl培养液中加入1M、2.5M、5M2-me2后VEGF、EPO、IGF-1表达都明显降低(p2.5M2-me2作用下VEGF、EPO、IGF-1表达最低。结论(1)(0-100uM)CoCl作用BMSCs12h、24h、36h、48h后对细胞没有明显的毒性作用。(2)(0-100uM)CoCl对BMSC作用12h、24h、36h、48h后对细胞增殖没有明显的影响。(3)CoCl能促进BMSCs分泌生长因子，25M CoCl作用BMSCs36h为促进VEGF、EPO、IGF-1蛋白表达的最适条件。(4)2-me2可抑制CoCl促进BMSCs分泌生长因子的作用，2.5M2-me2为抑制25M CoCl作用BMSCs36h条件下VEGF和EPO表达的最适浓度。第二部分探讨BMSCs条件培养基改善HIBD大鼠认知功能中的作用目的建立新生大鼠培养基持续脑室内灌注的技术手段以及探讨BMSCs条件培养基改善HIBD大鼠认知功能中的作用。方法生后7日龄HIBD大鼠40只。随机分为培养基对照组(DmeM组，n=8)、骨髓间充质干细胞培养上清液组(BMSCs-DmeM组，n=8)、CoCl作用骨髓间充质干细胞后的培养基上清液组(CoCl-DmeM组，n=8)、CoCl作用下的骨髓间充质干细胞以及培养基上清液组(CoCl-DmeM+BMSCs组，n=8)、CoCl和2-me2共同作用骨髓间充质干细胞后的培养基上清液组(CoCl+2-me2-DmeM组，n=8)。收集浓缩相应的培养基并通过Alzet微型真空泵的方式连续7天注入10日龄HIBD大鼠左侧脑室。大鼠生后7周行Morris水迷宫观察CoCl对大鼠空间学习记忆能力的影响;大鼠生后8周通过HE、尼氏染色对各组进行病理学观察;ELISA定量检测脑组织VEGF、EPO、IGF-1水平;采用神经电生理技术检测各组HIBD大鼠海马脑片LTP诱发;免疫荧光检测各组HIBD大鼠的突触可塑性关键指标AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionatereceptor, AMPAR)的GluR2亚基的表达情况。结果(1)各组HIBD大鼠在持续7天脑室内灌注条件培养基后的一般情况：摄食、睡眠情况良好，毛发光亮，行为活动无异常，精神可。(2)水迷宫行为学测试观察条件培养基对HIBD大鼠认知功能的作用：CoCl-DmeM组和CoCl-DmeM+BMSCs组与DmeM组比较,平均潜伏期均明显缩短，穿越平台区域的时间增加，空间学习记忆能力部分恢复(P meM组和BMSCs-DmeM组较CoCl-DmeM组

关键词：氯化钴 BMSCs HIF-1 2-me2 LTP HIBD 脑室灌注

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2-甲氧基雌二醇联合环磷酰胺对乳腺癌荷瘤小鼠疗效分析

2-甲氧基雌二醇联合环磷酰胺对乳腺癌荷瘤小鼠疗效分析

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作者：赵茂勋南华大学

学位级别：硕士

目的观察经2-me2和环磷酰胺（CTX）对小鼠晚期乳腺癌模型的抑瘤作用，初步探讨新药2-me2与传统化疗药物环磷酰胺(CTX)结合是否能够提高疗效。方法建立BALB/c4T1小鼠乳腺癌模型，随机分为生理盐水对照组、2-me2组、CTX组、2-me2+CTX联合... 详细信息

目的观察经2-me2和环磷酰胺（CTX）对小鼠晚期乳腺癌模型的抑瘤作用，初步探讨新药2-me2与传统化疗药物环磷酰胺(CTX)结合是否能够提高疗效。方法建立BALB/c4T1小鼠乳腺癌模型，随机分为生理盐水对照组、2-me2组、CTX组、2-me2+CTX联合组，观察肿瘤生长情况;给药3周后，取出瘤组织和双肺，计算抑瘤率和肺转移率。免疫组化SP法检测瘤组织HIF-1α、VEGF蛋白表达以及微血管密度（microvessel density，MVD）。结果（1）2-me2+CTX联合组的抑瘤率高于2-me2组、CTX组。（2）各组荷瘤小鼠肺脏转移情况：联合组转移灶数目明显低于2-me2组及CTX，有统计学意义（P＜0.05）。（3）联合用药组移植瘤MVD以及HIF-1α、VEGF蛋白表达明显低于2-me2组和CTX组（P 2-me2联合CTX对BALB/c4T1小鼠乳腺癌的疗效优于单用CTX或2-me2。（2）在抑制BALB/c4T1小鼠乳腺癌移植瘤血管新生方面，2-me2、CTX两药具有相互增强作用。

关键词：晚期乳腺癌 2-me2 CTX 免疫组化血管新生

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