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柱前衍生化高效液相色谱法准确测定2-氯丙酸的光学纯度

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分析化学 2007年第8期35卷 1195-1198页

作者：李俊峰都婷婷兰先秋张义文宋航四川大学制药与生物工程系四川大学制药与生物工程系成都610065

用1-萘胺对2-氯丙酸进行柱前衍生化,衍生化反应在30℃条件下进行10min或更长时间。选择ChiralcelOD-H色谱柱和正己烷-醇类为流动相,考察了流动相组成和柱温的变化对2-氯丙酸衍生物对映体拆分效果的影响。确定流动相为V(正己烷):V(甲醇)... 详细信息

用1-萘胺对2-氯丙酸进行柱前衍生化,衍生化反应在30℃条件下进行10min或更长时间。选择ChiralcelOD-H色谱柱和正己烷-醇类为流动相,考察了流动相组成和柱温的变化对2-氯丙酸衍生物对映体拆分效果的影响。确定流动相为V(正己烷):V(甲醇):V(乙醇)=50:45:5,流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长224nm为较优分析条件,分离因子2.5,8min内出峰。现有文献和试剂手册提供的2-氯丙酸的比旋光度标准值之间相差很大,在实际测量和计算中无准确标准可依。柱前衍生化结合手性固定相色谱方法灵敏度高,重现性好,操作较简单,可用于准确测量2-氯丙酸的光学纯度,并准确给出一定条件下2-氯丙酸的比旋光度和光学纯度的对应关系([α]D20-13.94(neat,d1.2547),e.e.97.9%)。

关键词： 2-氯丙酸柱前衍生化手性固定相高效液相色谱光学纯度

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2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化

2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化

作者：项炯华浙江大学

学位级别：硕士

2-氯丙酸(2-CPA)是合成农药、染料、农林和医药化学品等的重要原料,但是,由于2-氯丙酸具有光学活性,一般只有用(S)-构型2-氯丙酸合成的农药、医药等才具有很高的生理活性或药理作用,用(R)-构型合成的农药活性很低或无活性,且可能以竞争... 详细信息

2-氯丙酸(2-CPA)是合成农药、染料、农林和医药化学品等的重要原料,但是,由于2-氯丙酸具有光学活性,一般只有用(S)-构型2-氯丙酸合成的农药、医药等才具有很高的生理活性或药理作用,用(R)-构型合成的农药活性很低或无活性,且可能以竞争性抑制剂的形式起作用。而(R)-构型的2-氯丙酸在其它某些手性医药及其中间体的合成方面有很重要的应用,如可用于合成抗结核病药物硫乳霉素(thiolactomycin)。 2-氯丙酸脱卤酶有3种,分别为(S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.***.1.2)、(R)-2-卤酸脱卤酶(EC3.***.1.9)、(R,S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.***.1.10及EC3.***.1.11)。利用脱卤酶可选择性地高效拆分2-氯丙酸。本文的研究目的是筛选对2-氯丙酸具有脱氯能力的菌株,并建立脱卤酶的分离纯化方法,从而为利用脱卤酶生产(S)-及(R)-构型光学活性2-氯丙酸奠定基础。本文首先从杭州、温州、富阳等农药厂附近所采集的11个土样出发,筛选出了21支对2-氯丙酸具有脱卤活性的菌株。其中H9脱卤能力较强,S4和W20脱卤酶分别对(S)-2-CPA和(R)-2-CPA具有一定的选择性脱卤能力。由于(R)构型脱卤酶的应用更为广泛,因此本文重点针对W20脱卤酶进行了分离纯化研究,经过盐析、脱盐、离子交换层析、凝胶层析后获得了电泳纯的脱卤酶,SDS-PAGE测定酶的分子量为35KDa。对部分酶学性质作了考察后发现,W20酶的最适反应pH值为10,最适反应温度为40℃。最后对W20培养条件进行了考察。最佳培养基的碳源和氮源组合为葡萄糖和尿素。当碳源葡萄糖浓度为20g/L,氮源尿素浓度为1.0g/L时,可以获得较多的菌体和脱卤酶。对菌体的培养温度及培养pH进行考察,发现30℃是菌体生长较适宜的温度,pH7.0是菌体较适宜的培养pH值。

关键词： 2-氯丙酸脱卤酶菌种筛选分离纯化酶学性质

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2-氯丙酸脱卤酶的定向进化

2-氯丙酸脱卤酶的定向进化

作者：刘鹏浙江大学

学位级别：硕士

2-氯丙酸是一种重要的化工中间体,被广泛应用于医药、染料、农药等行业。使用2-氯丙酸脱卤酶制备光学纯2-氯丙酸的有重要的意义。本文首先通过易错PCR手段将S-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并筛选得到进化酶DehⅡ-B2,该酶的最适pH为9.5,最... 详细信息

2-氯丙酸是一种重要的化工中间体,被广泛应用于医药、染料、农药等行业。使用2-氯丙酸脱卤酶制备光学纯2-氯丙酸的有重要的意义。本文首先通过易错PCR手段将S-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并筛选得到进化酶DehⅡ-B2,该酶的最适pH为9.5,最适温度为60℃,Vmax和Km的值分别为2.63×10-3mM·min-1和0.75mM。进化酶的比活比原始酶提高了3.9倍。通过分子模拟和分子对接发现,DehII-B2的活化能下降了1.4kcal/mol,催化残基Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.3216m。在两者的综合作用下使酶活力提高。其次,通过定点突变改造R-2-氯丙酸脱卤酶的Asn203位点。发现当该位点突变为ser203时,酶的选择性由催化R-2-氯丙酸转化为催化S-2-氯丙酸,比活降到0.101U/mg;当该位点突变为Gln203时,酶的选择性未变,但是比活降低了17%。突变为其他氨基酸均失活。同源建模结果表明空间位阻效应和氢键作用可以很好的解释各种突变体的比活变化。最后,通过易错PCR手段将R-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并筛选得到有效突变子库,突变子DehDIV-G2和DehDIV-E7的酶活力分别提高24.8%和39.6%。通过SYBYL对酶与底物进行分子对接显示,DehDIV-G2的活化能下降0.23kcal/mol, DehDIV-E7的活化能下降0.61kcal/mol。由于酶和底物R-2-氯丙酸的活化能下降,亲和能力提高,从而提高酶活力。

关键词： 2-氯丙酸脱卤酶定向进化理性设计分子模拟

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S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用

中国生物工程杂志 2012年第5期32卷 66-72页

作者：刘鹏林春娇杨立荣徐刚吴坚平浙江大学化学工程与生物工程学系杭州310027

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas *** 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶De... 详细信息

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas *** 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。

关键词： 2-氯丙酸脱卤酶定向进化分子对接

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光学纯2-氯丙酸的拆分研究

河北师范大学学报（自然科学版） 2010年第6期34卷 712-714页

作者：张宝华史兰香石家庄学院化工学院河北石家庄050035

报道了使用光学纯的α-萘乙胺拆分外消旋2-氯丙酸制备(R)-(+)-2-氯丙酸和(S)-(-)-2-氯丙酸的新方法.(R)-(+)-2-氯丙酸收率28%,e.e.值97.2%,(S)-(-)-2-氯丙酸收率12%,e.e.值95.6%.适宜的拆分条件为异丙醇-水为溶剂,n((±)-2-氯丙酸))∶n(拆分剂)=1∶1,反应温度50℃.对(-)-α-萘乙胺和(+)-α-萘乙胺的回收使用进行了研究,回收率分别为70%和51%,重复使用5次,拆分效果不变.

关键词： 2-氯丙酸 (-)-α-萘乙胺 (+)-α-萘乙胺 (R)-(+)-2-氯丙酸 (S)-(-)-2-氯丙酸拆分

柱前衍生-气相色谱法测定2-氯丙酸的光学纯度

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理化检验（化学分册） 2011年第9期47卷 1034-1036,1039页

作者：赵接红李东王未鲜陈玉波熊金龙淮安市产品质量监督检验所淮安223001 江苏省盐化工产品质量监督检验中心淮安223001 国家盐化工产品质量监督检验中心(筹) 淮安223001 淮阴工学院生命科学与化学工程学院淮安223003

提出了柱前衍生-气相色谱法测定2-氯丙酸的光学纯度。在无水硫酸镁存在下,相同体积的2-氯丙酸与二氯亚砜在冰浴中进行衍生反应30 min,所得2-氯丙酸衍生物2-氯丙酸甲酯消旋体经CYCLOSIL-B手性气相色谱柱分离,柱温为65℃。R-(+)-2-氯丙酸... 详细信息

提出了柱前衍生-气相色谱法测定2-氯丙酸的光学纯度。在无水硫酸镁存在下,相同体积的2-氯丙酸与二氯亚砜在冰浴中进行衍生反应30 min,所得2-氯丙酸衍生物2-氯丙酸甲酯消旋体经CYCLOSIL-B手性气相色谱柱分离,柱温为65℃。R-(+)-2-氯丙酸甲酯和S-(-)-2-氯丙酸甲酯的分离度大于2.0。方法用于2-氯丙酸光学纯度的测定,所得测定值与理论值基本一致。

关键词：气相色谱法柱前衍生 2-氯丙酸光学纯度

光学纯2-氯丙酸及其酯的合成与在手性农药中的应用

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农药 2004年第8期43卷 363-366页

作者：文辉边庆花王敏中国农业大学理学院北京100094

总结了近 30年来关于光学纯 2 氯丙酸及其酯的合成方法的研究进展 ,主要包括由手性原料合成、生物酶和细菌法合成以及不对称合成等方法 ;另外还总结了该光学纯化合物在除草剂、杀菌剂等手性农药中的应用。

关键词： 2-氯丙酸 2-氯丙酸酯合成手性农药

固载化猪胰脂肪酶的制备及其在2-氯丙酸甲酯水解中应用

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浙江工业大学学报 2009年第1期37卷 32-35页

作者：施介华蔡栋材叶蒙浙江工业大学药学院浙江杭州310032

采用载体表面涂布法制备固载化猪胰脂肪酶并应用于2-氯丙酸甲酯的水解,主要考察了固载化过程中不同载体、加酶量、温度及pH值对固载化酶活力的影响.确定了固载化最佳工艺条件为:以硅胶为载体,pH值为7.2,温度为40℃,m(酶)∶m(载体)=1∶3... 详细信息

采用载体表面涂布法制备固载化猪胰脂肪酶并应用于2-氯丙酸甲酯的水解,主要考察了固载化过程中不同载体、加酶量、温度及pH值对固载化酶活力的影响.确定了固载化最佳工艺条件为:以硅胶为载体,pH值为7.2,温度为40℃,m(酶)∶m(载体)=1∶3.在所选择的固载化条件下制备的固载化猪胰脂肪酶的酶活力为150 IU.固载化猪胰脂肪酶(200 mg)用于2-氯丙酸甲酯(5mmol/50 mL,pH=7.2)进行水解,4 h水解率为10.5%,(R)-氯代丙酸的ee值达87%,与游离猪胰脂肪酶的光学选择性基本一致.

关键词：猪胰脂肪酶固载化 2-氯丙酸甲酯 2-氯丙酸水解

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2-氯丙酸及其酯的拆分研究进展

浙江工业大学学报 2006年第5期34卷 502-508页

作者：施介华金迪李祥周亮浙江工业大学药学院浙江杭州310032

2-氯丙酸是合成农药、染料和农林化学品的重要中间体,是一种重要的精细化工产品.光学活性的2-氯丙酸具有较高的生理活性或药理作用,是除草剂的重要组成部分,用于生产消炎解热镇痛药布洛芬、医药中间体2-丙氨酸以及农药中间体氯丙酸甲酯... 详细信息

2-氯丙酸是合成农药、染料和农林化学品的重要中间体,是一种重要的精细化工产品.光学活性的2-氯丙酸具有较高的生理活性或药理作用,是除草剂的重要组成部分,用于生产消炎解热镇痛药布洛芬、医药中间体2-丙氨酸以及农药中间体氯丙酸甲酯、氯丙酸乙酯等低级醇酯,也可用于生产乳酸.综述了近年来2-氯丙酸及其酯手性拆分国内外的研究和发展现状,其拆分技术主要包括化学拆分法、生物酶法拆分法、色谱拆分法和萃取拆分法等,比较了各种方法的优缺点,指出了将酶催化反应和化学合成结合,是2-氯丙酸及其酯拆分研究的新途径,对手性化合物的拆分与应用起到积极的推动作用.

关键词： 2-氯丙酸 2-氯丙酸酯拆分光学活性