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生命科学 2019年第6期31卷 534-543页

作者：李静刘如娟王恩多中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所/分子细胞科学卓越创新中心/分子生物学国家重点实验室上海200031 中国科学院大学北京100864 上海科技大学生命科学与技术学院上海201210

转移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)上存在着大量的转录后修饰,对tRNA发挥其生物学功能具有重要作用。甲基化修饰作为tRNA修饰中最广泛存在的一种,可以发生在核苷酸的碱基或者2’-o-核糖(2’-o-甲基化修饰)上。tRNA 2’-o-甲基化修饰广... 详细信息

转移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)上存在着大量的转录后修饰,对tRNA发挥其生物学功能具有重要作用。甲基化修饰作为tRNA修饰中最广泛存在的一种,可以发生在核苷酸的碱基或者2’-o-核糖(2’-o-甲基化修饰)上。tRNA 2’-o-甲基化修饰广泛存在于古细菌、原核生物和真核生物中,并且在tRNA第4位、6位、18位、32位、34位、39位、44位、54位和56位均被鉴定到。研究表明,tRNA 2’-o-甲基化修饰参与调控tRNA的折叠和成熟、影响tRNA稳定性及反密码子与mRNA密码子配对的精确性,并与细胞生长、压力应激和免疫调控密切相关。人细胞质tRNA 2’-o-甲基化修饰缺陷常常与疾病密切相关,并且潜在的tRNA 2’-o-甲基修饰酶已经成为药物研发的新靶点。开展tRNA 2’-o-甲基化修饰及其修饰酶的研究将丰富人们对tRNA 2’-o-甲基化修饰的生物学功能的认识,并为探索tRNA 2’-o-甲基修饰酶在人类疾病中的致病机制打下基础。现将简要介绍已报道的tRNA 2’-o-甲基化修饰及其修饰酶的生物学功能。

关键词： tRNA 转录后修饰 2’-o-甲基化修饰 2’-o-甲基修饰酶生物学功能

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一种从人体组织中纯化小RNA用于LC-MS/MS甲基化分析的新方法

一种从人体组织中纯化小RNA用于LC-MS/MS甲基化分析的新方法

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作者：吴安妮南京大学

学位级别：硕士

小RNA作为RNA沉默的核心组成部分,在真核生物的许多生物过程中发挥着多种多样的重要作用。小RNA水平的异常降低或升高与许多发育和生理缺陷有关。小RNA的体内水平是通过调节其生物发生和周转的速度精确调控的,3’端核糖上的2’-o-甲基... 详细信息

小RNA作为RNA沉默的核心组成部分,在真核生物的许多生物过程中发挥着多种多样的重要作用。小RNA水平的异常降低或升高与许多发育和生理缺陷有关。小RNA的体内水平是通过调节其生物发生和周转的速度精确调控的,3’端核糖上的2’-o-甲基化是提高小RNA稳定性的主要机制。最近,新出现的证据表明,几乎任何类型的细胞小RNA的3’端都有2’-o-甲基化修饰,包括植物中的miRNA和siRNA,动物和人类中的miRNA、piRNAs和tsRNAs。单个小RNA的甲基化修饰可以通过液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)来确定。然而,LC-MS/MS分析需要高纯度的单个小RNA。由于从组织或细胞中纯化特异性小RNA的困难性,LC-MS/MS在表征小RNA甲基化方面的研究进展有限。在这里,我们报道了一种从人体组织中有效纯化小RNA用于LC-MS/MS甲基化分析的新方法。该方法包括两个步骤:1)RNA pulldown实验,将从人体组织中提取的总小RNA与目标小RNA的生物素化反义寡核苷酸孵育,该寡核苷酸与目标小RNA反义,但其5′末端含有额外的两个A残基,以确保其分子量比靶向小RNA大得多。然后通过链霉亲和素磁珠捕捉生物素化反义寡核苷酸-小RNA结合复合物,再用水将目标小RNA洗脱下来,通过RNA pulldown实验,得到的目标小RNA纯度可以达到约70%;2)使用核酸外切酶I处理纯化的小RNA,以降解可能与目标小RNA一起洗脱下来的DNA寡核苷酸,之后加入与目标小RNA序列互补的单链DNA,形成DNA/RNA杂交双链,从而在后续酶消化过程中保护目标小RNA,之后依次用核酸酶S1和DNA酶I进行消化。利用4对合成的甲基化和非甲基化小RNA的混合物,我们通过优化核酸酶S1处理条件进一步完善了这种两步法,其分离出的目标小RNA的纯度可到99%。利用这种方法,我们成功地从人正常肺和精子组织样品中纯化了miR-21-5p、miR-26-5p、piR-020485和tsRNA,并通过LC-MS/MS分析了其3’端2’-o甲基化修饰。

关键词：小RNA 2’-o-甲基化修饰两步法 LC-MS/MS

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