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中国医药工业杂志 2017年第11期48卷 1604-1609页

作者：黎梦刘国生刘磊常利草邢善涛河南师范大学生命科学学院功能微生物绿色转化技术河南省工程实验室河南新乡453007 新乡拓新生化科技有限公司河南新乡453000

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa TX16)具有腺苷脱氨酶活性,可以催化2,6-二氨基嘌呤核苷脱氨合成阿糖鸟苷,但铜绿假单胞菌TX16是一种条件致病菌,直接用于工业生产存在一定风险。将铜绿假单胞菌TX16菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa TX16)具有腺苷脱氨酶活性,可以催化2,6-二氨基嘌呤核苷脱氨合成阿糖鸟苷,但铜绿假单胞菌TX16是一种条件致病菌,直接用于工业生产存在一定风险。将铜绿假单胞菌TX16菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆至载体p ET-28a中,然后转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经过筛选获得工程菌E.coli(add)。经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测及酶活力测定,表明E.coli(add)能够表达大量腺苷脱氨酶,其产酶能力是含空载质粒的BL21(DE3)菌株E.coli(p ET-28a)的16.2倍。以E.coli(add)制备的粗酶液为催化剂,催化阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷发生脱氨反应得到产物阿糖鸟苷,转化率可达96.8%。

关键词：阿糖鸟苷 2,6-二氨基嘌呤核苷铜绿假单胞菌腺苷脱氨酶基因表达

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合成阿糖鸟苷关键酶的基因克隆与表达

合成阿糖鸟苷关键酶的基因克隆与表达

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作者：黎梦河南师范大学

学位级别：硕士

核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源,阿糖鸟苷(ara-G)作为奈拉滨等的前药,能够有目的地抑制T细胞白血病的细胞活性,也是一种关键的抗癌类核苷类药物。目前利用化学合成法工艺比较麻烦,使用某些化学试剂对人体和环境都可能造成一... 详细信息

核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源,阿糖鸟苷(ara-G)作为奈拉滨等的前药,能够有目的地抑制T细胞白血病的细胞活性,也是一种关键的抗癌类核苷类药物。目前利用化学合成法工艺比较麻烦,使用某些化学试剂对人体和环境都可能造成一定的危害;而生物催化法在一定程度上可以解决上述问题,但也存在野生菌株酶产量较低而导致成本较高、同时一些产酶的微生物菌体本身可能具有致病性,从而阻碍了工业化生产。本文通过分子生物学技术对ara-G生物合成过程中所用关键酶进行克隆表达,以获得催化反应所用酶的高产基因工程菌,大幅度降低成本,为工业化生产奠定基础。1.嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)与尿苷磷酸化酶基因(udp)工程菌的构建:根据GenBank中的deoD与udp的序列设计引物,利用PCR扩增来源于埃希氏菌AEM0812菌株的deoD与udp基因,将基因片段分别与克隆载体pMD18-T连接得到重组质粒pMD18-T-deoD和pMD18-T-udp,再将重组质粒分别导入Escherichia coli DH5α获得目的基因的克隆;然后将目的基因分别与表达载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-deoD和pET-28a-udp,导入E.coli BL21(DE3),获得工程菌菌株E.coli(deoD)、E.coli(udp);经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测表明目的基因表达成功。工程菌E.coli(deoD)与E.coli(udp)粗酶液酶活力分别是原始菌株的1.9倍与1.2倍。2.工程菌E.coli(deoD)或E.coli(udp)催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA):利用E.coli(deoD)或E.coli(udp)游离细胞或由其制备的粗酶液分别催化第一步反应,均能够生成ara-DA,并且E.coli(deoD)与E.coli(udp)游离细胞转化率比原始菌株AEM0812分别提高24.6%与22.3%,E.coli(deoD)与E.coli(udp)的粗酶液比原始菌株分别提高28.2%与2.0%;将E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞或粗酶液按照1:1的比例混合参与反应时,转化率相对于原始菌株AEM0812有明显的提高,尤其是E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞的混合液效果最佳,转化率是原始菌株的2.5倍。3.腺苷脱氨酶基因(add)工程菌的构建:将来源于Pseudomonas aeruginosa TX16菌株的add基因克隆后导入E.coli BL21(DE3),得到含有重组质粒pET-28a-add的工程菌E.coli(add),经IPTG诱导后采用SDS-PAGE检测,表明目的基因表达成功。酶活测定表明E.coli(add)粗酶液的酶活力是原始菌株P.aeruginosa TX16的2.9倍。4.工程菌E.coli(add)催化合成ara-G:将E.coli(add)菌体直接加入到含有ara-DA的反应体系中,HPLC检验结果表明E.coli(add)菌体游离细胞几乎不能催化合成ara-G;将E.coli(add)菌体细胞破碎后制成粗酶液再进行反应,可以成功催化第二步反应生成ara-G,而且转化率比原始菌P.aeruginosa TX16有非常显著的提高,其转化率可达96.8%,是原始菌株的2.2倍。

关键词：核苷类化合物 2,6-二氨基嘌呤核苷阿糖鸟苷基因克隆与表达生物催化

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2’-O-甲基核苷衍生物的合成研究

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作者：赵赞赞北京交通大学

学位级别：硕士

2’-O-甲基修饰的核糖核苷是合成第二代反义寡核苷酸的基本组成原料,作为重要的药物中间体,研究这类核苷衍生物的合成具有重要的实际意义。本论文对2’-O-甲基-5’-O-（4,4’-二二甲氧基三苯基甲基）-N6-苯甲酰基腺苷和2’-O-甲基-5’-O... 详细信息

2’-O-甲基修饰的核糖核苷是合成第二代反义寡核苷酸的基本组成原料,作为重要的药物中间体,研究这类核苷衍生物的合成具有重要的实际意义。本论文对2’-O-甲基-5’-O-（4,4’-二二甲氧基三苯基甲基）-N6-苯甲酰基腺苷和2’-O-甲基-5’-O-（4,4’-二二甲氧基三苯基甲基）-N2-异丁酰基鸟苷的合成路线进行了研究,并通过红外光谱和核磁氢谱分析证明合成物质为目标化合物。以腺苷为原料,与碘甲烷反应,腺苷糖环上的2’位羟基烷基化,得到2’-O-甲基腺苷;苯甲酰氯对碱基上的N6-氨基进行保护,4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷保护糖环5’位羟基,制备出2’-O-甲基-5’-O-（4,4’-二甲氧基三苯基甲基）-N6-苯甲酰基腺苷,总收率为31%。以2,6-二氨基嘌呤核苷为原料,经过碘甲烷与2’位羟基烷基化反应、腺苷脱氨酶反应得到2’-O-甲基鸟苷;用异丁酰氯对嘌呤环的N2-氨基进行保护,4,4’-二二甲氧基三苯基氯甲烷保护糖环5’位羟基,制备出2’-O-甲基-5’-O-（4,4’-二二甲氧基三苯基甲基）-N2-异丁酰基鸟苷,总收率为37%。上述合成路线操作简单、成本较低、对环境污染较小,符合绿色化学的要求,中试实验稳定,适用于工业化生产。

关键词：腺苷 2,6-二氨基嘌呤核苷烷基化酰化反应腺苷脱氨酶

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