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以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建

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食品与发酵工业 2020年第1期46卷 1-10页

作者：曹艳丽张丽杰徐岩工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

构建一种以L-苏氨酸为发酵底物的高值化学品2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)生产菌株,为解决L-苏氨酸产能过剩,实现2,5-DMP生物法生产提供可靠思路。通过利用Bacillus subtilis 168(*** 168)外源表达不同微生物种属来源... 详细信息

构建一种以L-苏氨酸为发酵底物的高值化学品2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)生产菌株,为解决L-苏氨酸产能过剩,实现2,5-DMP生物法生产提供可靠思路。通过利用Bacillus subtilis 168(*** 168)外源表达不同微生物种属来源的L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase,TDH),并比较其利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP的产量,挑选出2,5-DMP高产菌种,在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX),以促进辅因子再生。实验构建了1株高产2,5-DMP的基因工程菌株*** 168/pMA0911-tdh(E.c)-nox。该菌株以5.83 g/L的L-苏氨酸为底物,发酵24 h后2,5-DMP的产量高达616.04 mg/L,与对照菌株*** 168/pMA0911相比,产量提高了22.5倍。在TDH过表达的基础上,NOX的参与有利于2,5-DMP产量的提高。该研究首次实现了2,5-DMP高效的生物转化,一方面缓解了L-苏氨酸产能过剩的困境,另一方面有助于实现高值风味化合物2,5-DMP的生物法生产。

关键词： 2,5-二甲基吡嗪 L-苏氨酸 L-苏氨酸脱氢酶 NADH氧化酶生物转化枯草芽孢杆菌

金属卟啉催化氧气氧化2，5-二甲基吡嗪的研究

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金属卟啉催化氧气氧化2，5-二甲基吡嗪的研究

作者：董阳阳北京工业大学

学位级别：硕士

5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)，是一种重要的医药中间体，主要用于合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(PAE)。... 详细信息

5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)，是一种重要的医药中间体，主要用于合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(PAE)。论文首先综述了5-甲基吡嗪-2-羧酸的应用及合成研究进展，通过介绍5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成研究方法，分析了不同合成方法的优缺点。目前合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，主要存在催化剂用量大，难以从反应体系分离;需要在酸性介质中进行，对反应容器腐蚀较大;反应进程难以控制，容易发生深度氧化，副产物较多。金属卟啉能模拟单加氧酶细胞色素P-450实现温和条件下对分子氧的催化活化，尤其是取代金属卟啉在催化氧化反应中表现出较高的催化活性和选择性，由此我们设计在温和的条件下以金属卟啉为催化剂，氧气为氧化剂，催化氧化2,5-二甲基吡嗪，制取5-甲基吡嗪-2-羧酸，并取得了不错的研究成果。本课题以不同的金属卟啉催化氧气氧化2,5-二甲基吡嗪，通过绿色的化学工艺过程控制反应进程以及氧化深度，提高反应的转化率及其目标产物的选择性，主要研究碱性条件下，金属卟啉仿生催化氧气氧化2,5-二甲基吡嗪制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。重点考察卟啉催化剂种类及用量、反应温度、碱浓度、氧气压力、反应时间等因素对反应收率及目标产物酸选择性的影响。通过反应机理的分析研究，解释金属卟啉与氢氧化钠协同催化的实质，进一步论证了氢氧化钠不存在时反应难以进行的原因。实验结果表明，以T(p-Cl)PPCoCl为催化剂时催化剂浓度为4.0×10mol/L，在反应温度为100oC、氧气压力为1.5MPa、氢氧化钠浓度为0.375mol/L、2,5-二甲基吡嗪浓度为0.15mol/L、反应时间为8h，2,5-二甲基吡嗪的转化率是21.69%，5-甲基吡嗪-2-羧酸的选择性和收率分别为92.68%和20.10%

关键词： 5-甲基吡嗪-2-羧酸金属卟啉氧气氧化 2,5-二甲基吡嗪

构建重组大肠杆菌高效合成2,5-二甲基吡嗪

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构建重组大肠杆菌高效合成2,5-二甲基吡嗪

作者：杨晨江南大学

学位级别：硕士

2,5-二甲基吡嗪是一种广泛应用于食品及医药领域的高附加值产品,可作为合成格列吡嗪、阿昔莫司等抗高血压或降血糖类药物的中间体,也可作为食品添加剂。目前,制备2,5-二甲基吡嗪最常用的方法是化学合成法,但是该方法往往存在着产品分离... 详细信息

2,5-二甲基吡嗪是一种广泛应用于食品及医药领域的高附加值产品,可作为合成格列吡嗪、阿昔莫司等抗高血压或降血糖类药物的中间体,也可作为食品添加剂。目前,制备2,5-二甲基吡嗪最常用的方法是化学合成法,但是该方法往往存在着产品分离困难和有毒副产物生成等问题,对2,5-二甲基吡嗪在食品工业上的应用造成了很大的限制。相比之下,生物合成工艺制备2,5-二甲基吡嗪的过程温和,对环境污染较小,更适用于食品生产。但是2,5-二甲基吡嗪的生物合成效率很低,无法满足工业生产的需求,为了解决这一问题,本研究通过基因编辑手段对大肠杆菌胞内代谢流进行了重排,成功构建了高效合成2,5-二甲基吡嗪的微生物细胞工厂,为2,5-二甲基吡嗪的工业化生产及应用奠定了理论和实验基础。主要研究内容包括:(1)不同来源苏氨酸脱氢酶(L-threonine-3-dehydrogenase,TDH)的筛选。由于TDH是2,5-二甲基吡嗪生物合成途径的唯一关键酶,本研究选取不同来源的TDH并在*** BL21中进行外源表达,通过SDS-PAGE分析,酶活测定,以及重组菌株全细胞催化合成2,5-二甲基吡嗪产量检测,发现*** K-12来源的TDH催化活力最高,成功构建重组菌株*** BL21/pET28a-Ectdh,比酶活为132.0 m U·mg,该重组菌株全细胞催化合成2,5-二甲基吡嗪产量为603.0 mg·L,远高于其余5株重组菌株,因此选择该重组菌株作为后续研究的基础菌株;(2)氨基丙酮氧化酶的外源表达。为了提高中间产物氨基丙酮非酶催化合成2,5-二甲基吡嗪的效率,本研究引入外源的氨基丙酮氧化酶(aminoacetone oxidase,So AAO),构建了重组菌株*** BL21/pET28a-Ectdh-soaao,经酶活测定,So AAO的比酶活为83.6m U·mg,该重组菌株全细胞催化合成2,5-二甲基吡嗪产量为1006.0 mg·L,相比TDH单表达重组菌株*** BL21/pET28a-Ectdh有显著增加,证实了So AAO对2,5-二甲基吡嗪的合成具有促进作用;(3)敲除kbl基因阻断分支碳流代谢途径。在2,5-二甲基吡嗪合成途径中存在2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase,KBL),其可以催化L-苏氨酸生成甘氨酸,影响2,5-二甲基吡嗪的合成效率,因此本研究通过CRISPR-cas9敲除kbl基因构建了合适的底盘细胞,同时共表达TDH和So AAO,构建了重组菌株*** BL21Δkbl/pET28a-Ectdh-soaao。该重组菌株全细胞催化合成2,5-二甲基吡嗪的产量为1528.0 mg·L,碳原子得率为28.2%,相比重组菌株*** BL21/pET28a-Ectdh-soaao具有明显提高,证实了KBL对2,5-二甲基吡嗪的合成具有抑制作用;(4)优化全细胞催化反应条件并进行体系放大实验。优化重组菌株*** BL21Δkbl/pET28a-Ectdh-soaao全细胞催化合成2,5-二甲基吡嗪的反应条件,优化后的条件为:温度40℃、pH 9.0、底物浓度10 g·L,在此条件下进行5 L发酵罐放大试验。全细胞催化24 h,2,5-二甲基吡嗪产量达到1682.0 mg·L,碳原子得率30.2%,产量为目前报道最高水平,碳原子得率相比目前报道最高水平(17.0%)也有显著提升。

关键词： 2,5-二甲基吡嗪苏氨酸脱氢酶氨基丙酮氧化酶 2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶

枯草芽孢杆菌合成2,5-二甲基吡嗪途径解析及高产菌株构建

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枯草芽孢杆菌合成2,5-二甲基吡嗪途径解析及高产菌株构建

作者：曹艳丽江南大学

学位级别：硕士

烷基吡嗪是一类含有烷基基团的含氮杂环化合物,作为重要的风味贡献化合物广泛存在于发酵食品中。其中,2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine,2,5-DMP)因具有浓厚的烘烤气味而对发酵食品的风味贡献更加独特。此外,2,5-DMP还可以作为重要... 详细信息

烷基吡嗪是一类含有烷基基团的含氮杂环化合物,作为重要的风味贡献化合物广泛存在于发酵食品中。其中,2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine,2,5-DMP)因具有浓厚的烘烤气味而对发酵食品的风味贡献更加独特。此外,2,5-DMP还可以作为重要的医药和香料中间体,其生产方法主要为化学合成。因2,5-DMP的微生物合成途径未被阐明,使得2,5-DMP在微生物合成领域缺乏研究。在前期工作中,本课题组在酱香型白酒的高温大曲中筛选到一株Bacillus subtilis XZ1124,L-苏氨酸的添加有利于该菌株合成2,5-DMP,暗示2,5-DMP可以通过微生物发酵生成。基于此结果,本研究以*** 168为研究对象,对2,5-DMP微生物合成途径进行了解析。在此基础上,推测2,5-DMP的微生物合成途径可能参与其他含单甲基半环的烷基吡嗪的微生物合成,并以三甲基吡嗪(2,3,5-Trimethylpyrazine,TMP)为例进行了验证。基于2,5-DMP微生物合成途径的解析,本研究构建了一株可以利用L-苏氨酸为底物高产2,5-DMP的基因工程菌株,首次实现了2,5-DMP高效的生物转化。本研究丰富了对烷基吡嗪微生物合成途径的认知,有助于改进发酵食品中重要风味物质2,5-DMP以及含单甲基半环的烷基吡嗪的合成及工艺控制。此外,将为实现2,5-DMP的生物转化或生物催化提供理论依据,进而有助于促进利用生物法生产2,5-DMP的研究与发展。主要研究内容包括:(1)2,5-DMP微生物合成途径的解析。通过底物添加培养、同位素示踪以及全细胞催化,确定了L-苏氨酸可以作为2,5-DMP微生物合成的唯一底物来源,氨基丙酮为2,5-DMP合成过程中的中间代谢物,其转化为2,5-DMP是一种pH依赖性的非酶促反应。通过来源于*** 168的苏氨酸脱氢酶(L-Threonine-3-dehydrogenase,TDH)纯酶催化L-苏氨酸以及*** 168菌株中TDH编码基因tdh的敲除和回补实验,确定了TDH是以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP微生物合成途径中的关键酶,其催化L-苏氨酸生成氨基丙酮。通过*** 168菌株中2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(2-Amino-3-ketobutyrate CoA ligase,KBL)编码基因kbl的敲除与回补实验,发现与TDH编码基因tdh共转录的kbl基因在2,5-DMP微生物合成途径中起着重要作用,kbl编码酶KBL可显著降低微生物利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP的能力。(2)TMP微生物合成途径的初步解析。通过同位素示踪和全细胞催化实验,确定了微生物可以同时利用L-苏氨酸和D-葡萄糖或单独利用L-苏氨酸生成TMP。另外,通过*** 168菌株中TDH编码基因tdh的敲除和回补实验,发现以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP微生物合成途径中的关键酶TDH在以L-苏氨酸为底物的TMP微生物合成途径中同样起着关键作用,2,5-DMP微生物合成途径参与TMP的微生物合成,暗示2,5-DMP微生物合成途径可能参与其他含单甲基半环的烷基吡嗪的微生物合成。(3)以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP高产菌株的构建。通过在*** 168中外源表达七种不同微生物种属来源的TDH,发现来源于Escherichia coli K-12的TDH在*** 168中过表达更有利于*** 168利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP。在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)以促进辅因子NAD再生,发现在TDH过表达的基础上,NOX的参与促进了2,5-DMP产量的提高。本研究成功构建得到一株可以利用L-苏氨酸为底物高产2,5-DMP的基因工程菌株***168/pMA0911-tdh(E.c)-nox,该菌株可以在含有5.8 g?L的L-苏氨酸的LB液体培养基中发酵24 h,便可积累2,5-DMP产量高达616.0 mg?L,与对照菌株*** 168/pMA0911相比,产量提高了22.5倍。

关键词：枯草芽孢杆菌 L-苏氨酸 2,5-二甲基吡嗪三甲基吡嗪 L-苏氨酸脱氢酶 2-氨基-2-酮丁酸CoA连接酶

产二甲苯单加氧酶菌株的筛选、鉴定及转化2,5-二甲基吡嗪条件的优化

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化学与生物工程 2012年第9期29卷 19-25页

作者：刘丽娟薛亚平郑裕国浙江工业大学生物与环境工程学院浙江杭州310014

从土壤中筛选得到一株可以选择性氧化2,5-二甲基吡嗪生成5-甲基吡嗪-2-羧酸的产单加氧酶菌株ZJB-LLJ,经过生理生化鉴定及16S rDNA序列分析确定为恶臭假单胞菌。并对其转化2,5-二甲基吡嗪产5-甲基吡嗪-2-羧酸的条件进行了优化,结果表明,... 详细信息

从土壤中筛选得到一株可以选择性氧化2,5-二甲基吡嗪生成5-甲基吡嗪-2-羧酸的产单加氧酶菌株ZJB-LLJ,经过生理生化鉴定及16S rDNA序列分析确定为恶臭假单胞菌。并对其转化2,5-二甲基吡嗪产5-甲基吡嗪-2-羧酸的条件进行了优化,结果表明,在500mL摇瓶中装液100mL、温度为30℃、pH值为7～8、以对二甲苯为唯一碳源、诱导培养12h后添加底物的条件下,产物积累量最大;采用分批流加的方式积累产物较快,转化528h后5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度达20.41g·L-1,产率达到75.6%。

关键词： 5-甲基吡嗪-2-羧酸 2,5-二甲基吡嗪二甲苯单加氧酶筛选鉴定

枯草芽孢杆菌IFO 3013发酵产2，5-二甲基吡嗪的研究

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枯草芽孢杆菌IFO 3013发酵产2，5-二甲基吡嗪的研究

中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛

作者：宋焕禄姚秋宜吕跃钢北京工商大学化学与环境工程学院

2,5-二甲基吡嗪(2,5-DMP)是一类含氮的杂环分子,具有坚果的、咖啡的味道,主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等型香精。本文研究了用枯草芽孢杆菌 IFO 3013发酵法制备2,5-DMP,对整个发酵过程的发酵条件,产物提取方法和各种因... 详细信息

2,5-二甲基吡嗪(2,5-DMP)是一类含氮的杂环分子,具有坚果的、咖啡的味道,主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等型香精。本文研究了用枯草芽孢杆菌 IFO 3013发酵法制备2,5-DMP,对整个发酵过程的发酵条件,产物提取方法和各种因素的改变对产物产量的影响进行了探索。得到的最佳发酵条件是：L-苏氨酸添加量为40g/L,培养温度为40℃,pH 值控制在 7．5,摇床的转速为280r/min,在此条件下,2,5-二甲基吡嗪的发酵产量达到0．694 g/L。

关键词：枯草芽孢杆菌 L-苏氨酸发酵 2,5-二甲基吡嗪

来源： cnki会议评论

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2,5-二甲基吡嗪的合成

山东化工 2017年第5期46卷 10-13页

作者：张祚强齐鲁石化公司研究院山东淄博255434

2,5-二甲基吡嗪,是重要医药和香料中间体。2,5-二甲基吡嗪呈刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味,是我国GB2760-86规定为允许使用的香精。主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等香精。2,5-二甲基吡嗪又是制备5-甲基-吡嗪-2-羧... 详细信息

2,5-二甲基吡嗪,是重要医药和香料中间体。2,5-二甲基吡嗪呈刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味,是我国GB2760-86规定为允许使用的香精。主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等香精。2,5-二甲基吡嗪又是制备5-甲基-吡嗪-2-羧酸的重要原料。5-甲基吡嗪-2-羧酸是一种合成Glypizide的中间体。这种物质在结构上与磺脲衍生物的最终合成有关,并用于治疗与胰岛素无关的糖尿病。同时也是合成降血脂的药阿西莫司的中间体。本方法研究以一异丙醇胺为原料合成2,5-二甲基吡嗪的气相合成方法。

关键词： 2,5-二甲基吡嗪 5-甲基吡嗪-2-羧酸阿西莫司

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2，5-二甲基哌嗪合成工艺的研究

2，5-二甲基哌嗪合成工艺的研究

作者：郭一斐南京理工大学

学位级别：硕士

2,5-二甲基哌嗪是一种非常重要的化工原料和医药中间体,可用来合成医药、农药、染料和表面活性剂等多种精细化学品。2,5-二甲基哌嗪可以通过还原3,6-二甲基-2,5-二酮哌嗪、2,5-二甲基吡嗪以及催化氢化乳酰胺、一异丙醇胺制得。本文介绍... 详细信息

2,5-二甲基哌嗪是一种非常重要的化工原料和医药中间体,可用来合成医药、农药、染料和表面活性剂等多种精细化学品。2,5-二甲基哌嗪可以通过还原3,6-二甲基-2,5-二酮哌嗪、2,5-二甲基吡嗪以及催化氢化乳酰胺、一异丙醇胺制得。本文介绍了以一异丙醇胺为原料,催化脱氢加氢催化剂为催化剂合成2,5-二甲基哌嗪的情况,重点对以Raney-Ni为催化剂的反应进行了研究。对反应中催化剂用量、反应温度、压力、时间等因素进行研究,确定了反应的最佳条件:氢气初压2.0～3.0 MPa,反应温度150～170℃,反应时间4～6 h、Raney-Ni用量2.5～5.0 g·mol,在此工艺条件下,原料一异丙醇胺的转化率为100%,2,5-二甲基哌嗪的产率最高可达到70%,与文献相比反应条件要温和很多,其中反应压力由8.0 MPa下降到4.0 MPa,降幅达50%,反应温度也下降了50℃。同时也研究了以Ni-B非晶态合金、添加了Mo的Ni-B非晶态合金以及Cu/SiO为催化剂时的反应情况,产率与以Raney-Ni为催化剂相比还有较大的差距,转化率也不高。经过精馏可得纯度90%的2,5-二甲基哌嗪,再进行重结晶可得到纯度99%的2,5-二甲基哌嗪。通过改变反应温度、氢气初压等反应条件,可以实现对反应产物2,5-二甲基哌嗪和2,5-二甲基吡嗪的比例的控制。当反应温度为240℃、催化剂用量1.25 g·mol、氢气初压为0的条件下反应6 h,可以得到74.5%产率的2,5-二甲基吡嗪。

关键词： 2,5-二甲基哌嗪一异丙醇胺 2,5-二甲基吡嗪雷尼镍 Ni-B非晶态合金

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蝉虫草样品的分级萃取与化学成分分析

菌物学报 2019年第7期38卷 1149-1164页

作者：甘卓亭姚婷佘新松邹紫玲王思强唐敏韩燕峰黄山学院旅游学院安徽黄山245041 黄山学院分析测试中心安徽黄山245041 黄山学院生命与环境科学学院安徽黄山245041 贵州大学生命科学学院贵州贵阳550025

利用索氏萃取技术,依次采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇等5种溶剂对蝉虫草纯粉进行分级萃取,运用傅里叶变换红外光谱分析法和气相色谱-质谱联用技术对5级萃取物进行分析鉴定。傅里叶变换红外光谱分析显示萃取物中含有与烯... 详细信息

利用索氏萃取技术,依次采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇等5种溶剂对蝉虫草纯粉进行分级萃取,运用傅里叶变换红外光谱分析法和气相色谱-质谱联用技术对5级萃取物进行分析鉴定。傅里叶变换红外光谱分析显示萃取物中含有与烯烃类、羧酸类、酯类、醇类和酮类等化合物相关的C-H、C=O、C-O和C=C等官能团。气相色谱-质谱联用技术共鉴定出有机小分子化合物34种,以酯类和脂肪酸类为主,多为碳链长度为15–20的长链脂肪酸及对应的酯,其中十八碳不饱和脂肪酸相对含量高达28.95%;分别存在于两种或以上萃取物中的有机化合物共有11种;仅存于石油醚萃取物中的化合物6种,乙酸乙酯萃取物中3种,丙酮萃取物中2种,无水乙醇萃取物中6种,甲醇萃取物中6种。在一定极性范围内,利用溶剂的极性梯度变化,可实现蝉虫草中活性物质的按极性梯度分离;采用分级萃取技术可有效分离蝉虫草中部分化学成分。鉴定结果充实了蝉虫草中化合物的种类资源,为蝉虫草中活性物质谱图库的完善、构效关系的建立及蝉虫草产品的利用开发提供支撑。

关键词：蝉虫草 2,5-二甲基吡嗪长链脂肪酸傅里叶变换红外光谱气相色谱-质谱联用