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HSP90抑制剂17aag对HTLV-1感染HUT细胞株JAK3/STAT5信号通路的影响

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HSP90抑制剂17AAG对HTLV-1感染HUT细胞株JAK3/STAT5信号通路的影响

作者：杨清清广州医学院

学位级别：硕士

背景：成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia，ATL）是一种与人T细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV-Ⅰ）感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，急性期ATL侵袭性极强。ATL的预后不良因素与HTLV-1感染的细胞具有异常... 详细信息

背景：成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia，ATL）是一种与人T细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV-Ⅰ）感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，急性期ATL侵袭性极强。ATL的预后不良因素与HTLV-1感染的细胞具有异常强大的无限增殖以及抑制凋亡能力有关，亦与其对传统化疗药物的先天耐药性有关，因此目前迫切需要新的治疗方法改善ATL的不良预后。 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。很多研究成果都表明，JAK-STAT通路的异常激活在ATL的病理机制中占据着重要的地位。在ATL细胞中普遍存在着JAK-STAT信号通路的持续激活。热休克蛋白90（HSP90）在ATL细胞内的异常高水平表达被认为与ATL的发病有关。近年来研究表明，ATL细胞内多条信号转导通路相关蛋白均为HSP90的客体蛋白，并通过HSP90的作用被异常激活。正常细胞hsp90低水平表达，不与其他辅助分子伴侣形成复合物，处于非活化状态。但是，在恶性肿瘤细胞中，hsp90异常高水平表达，形成”客体蛋白-hsp90-辅助分子伴侣”的所谓超级分子伴侣复合物结构(辅助分子伴侣包括hsp70,CDC37)，稳定突变或异常活化的癌基因相关蛋白，使之免受泛素-蛋白酶体通路的降解作用，促进肿瘤细胞的异常增殖。本研究将以上所述作为理论基础，选用HTLV(+)ATL细胞株HUT-102作为研究对象，采用WESTERN-BLOT、免疫共沉淀、流式细胞术等多种现代生物学检测方法，探讨ATL细胞内HSP90与JAK/STAT通路异常持续性激活之间是否存在一定的联系，是怎样的联系，以此希望进一步加深对ATL发病机制的理解，为ATL的靶向治疗研究提供更多的理论依据。研究内容与方法： 1、细胞培养，使用RP-1640+10%胎牛血清配成完全培养基培养HUT-102细胞，并定期传代、换液。 2、WESTERN-BLOT方法： 2.1检测HUT-102细胞、JURKAT细胞以及外周血单个核细胞（PBMC）内JAK3蛋白、STAT5蛋白、P-STAT5蛋白、HSP90表达。观察各组细胞间蛋白表达量的不同。 2.2稀释不同浓度HSP90特异性抑制剂17-aag (0-2000NM)作用于HUT-102细胞24、48小时，分别提取各组细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。 2.3使用1000NM浓度17aag作用于HUT-102细胞0、3、6、9、12、24小时后提取细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。 2.4分别设入无刺激组、17aag+CP690550组、17-aag组、CP690550组分别刺激HUT-102细胞24h，提取处理细胞总蛋白WESTERN-BLOT检测JAK3蛋白表达情况 3、RT-PCR 将不同浓度（0、125、250、500、1000NM）抑制剂刺激HUT-102细胞24h后，提取细胞总RNA，使用RT-PCR方法检测各组细胞JAK3mRNA的表达情况，GAPDH为设定内参。 4、CCK8 稀释不同浓度17aag(0、500、1000、2000、4000、5000、8000NM)作用于HUT-102细胞，分别于12、24、48、72小时后CCK8法检测细胞吸光度值，计算细胞存活率。 5、AnnexinV-PI 稀释17aag浓度至0、250、500、1000、2000NM分别作用于HUT-102细胞，48小时后AnnexinV-PI法结合流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。 6、免疫共沉淀（CO-IP）将JAK3抗体、磁珠与HUT-102细胞总蛋白内JAK3蛋白相结合，将磁珠-蛋白-抗体复合物沉淀后去除磁珠跟抗体，WESTERN-BLOT检测沉淀蛋白内是否含有HSP90蛋白。结果 1、HSP90蛋白在正常人PBMC以及细胞株HUT-102、JURKAT中均有表达。但正常人HSP90蛋白表达量显著低于两种T淋巴肿瘤细胞株，JAK3/STAT5蛋白几乎不表达。与JURKAT细胞相比，HUT-102细胞内HSP90、JAK3、STAT5以及P-STAT5蛋白表达量显著增高。 2、CCK8结果显示,随着17aag浓度的增加以及孵育时间的增长，细胞存活率逐渐下降。其中17aag浓度在0-2000NM之间时下降最明显，在浓度达到2000NM以后细胞存活率达到最低值并趋于平稳。从时间上分析结果显示，随着孵育时间的延长，17aag对细胞的抑制

关键词： HSP90 JAK/STAT信号转导 17aag HUT-102细胞

游离17aag与17aag聚合物胶束对人非小细胞肺癌细胞放射增敏机制的研究

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游离17AAG与17AAG聚合物胶束对人非小细胞肺癌细胞放射增敏机制的...

作者：王叶苏州大学

学位级别：硕士

目的研究探讨17aag对非小细胞肺癌细胞系辐射敏感性影响;分析作为靶向药物纳米载体系统,17aag聚合物胶束是否较游离17aag对人非小细胞肺癌细胞系具有更高的抗肿瘤活性及研究探讨此效应产生的可能机制。方法应用MTT法检测游离17aag及17AA... 详细信息

目的研究探讨17aag对非小细胞肺癌细胞系辐射敏感性影响;分析作为靶向药物纳米载体系统,17aag聚合物胶束是否较游离17aag对人非小细胞肺癌细胞系具有更高的抗肿瘤活性及研究探讨此效应产生的可能机制。方法应用MTT法检测游离17aag及17aag聚合物胶束对非小细胞肺癌细胞活力的影响;克隆形成实验测定细胞存活率,应用单击多靶模型分析游离17aag及17aag聚合物胶束对细胞辐射敏感性的影响之间的差异;实验方法包括:细胞周期实验、免疫荧光染色实验、β-半乳糖苷酶染色实验、western-blot实验及小鼠动物模型实验。采用17aag聚合物胶束,增加难容药物的稳定性,分析药物联合X射线抑制非小细胞肺癌细胞生长的机制。结果1、MTT实验数据表明17aag聚合物胶束较游离17aag对非小细胞肺癌细胞的毒性作用大,两者均呈现时间、剂量依赖效应。克隆形成实验证实17aag胶束对细胞具有更明显的辐射增敏作用。2、游离17aag与17aag聚合物胶束与X射线联合作用均可引发明显的细胞衰老现象,呈现剂量依赖效应。据统计结果显示,17aag聚合物胶束在X射线各个剂量点引发的细胞衰老比例均高于游离17aag。3、游离17aag与17aag聚合物胶束联合X射线照射使肺癌细胞中的DNA损伤位点明显增多并使DNA修复延迟,17aag聚合物胶束引发效应与游离17aag组对比有差异。4、western-blot结果显示17aag与17aag聚合物胶束均使涉及MAPK信号通路的ERK激酶磷酸化受到明显抑制,MAPK信号通路被阻断。5、裸鼠动物模型试验中观察到游离17aag与17aag聚合物胶束具有明显的抑制肿瘤细胞生长及转移的作用,但相同浓度所起到的抑制效应并未呈现出明显差异。结论体外实验中,17aag聚合物胶束对三种肺癌细胞系的增殖抑制效应明显高于游离17aag,这可能与细胞衰老和DNA损伤修复延迟有关,Western-blot实验证实可能与MAPK通路的抑制效应有关;在裸鼠动物模型实验中,游离17aag与17aag聚合物胶束对肿瘤细胞均起到明显抑制作用。

关键词： 17aag HSP90 肿瘤增敏放射治疗聚合物胶束

抗癌抗生素格尔德霉素衍生物17aag的研究进展

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药学进展 2015年第8期39卷 598-602页

作者：易凤炎周长林顾觉奋中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009 南通秋之友生物科技有限公司江苏南通226200

格尔德霉素是一种苯醌安莎霉素类抗生素,有极强的抗肿瘤活性,其衍生物17aag(17-丙烯胺-17-去甲氧基格尔德霉素)是格尔德霉素的17位甲氧基被烯丙胺基取代所得,与格尔德霉素相比,其毒性更低,抗癌活性更高。综述17aag的作用机制、治疗应用... 详细信息

格尔德霉素是一种苯醌安莎霉素类抗生素,有极强的抗肿瘤活性,其衍生物17aag(17-丙烯胺-17-去甲氧基格尔德霉素)是格尔德霉素的17位甲氧基被烯丙胺基取代所得,与格尔德霉素相比,其毒性更低,抗癌活性更高。综述17aag的作用机制、治疗应用、药代动力学、毒性等研究进展。

关键词： 17aag 抗癌抗生素作用机制治疗应用药代动力学毒性

GW2974与17aag联合应用对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

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GW2974与17AAG联合应用对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素对原发性肝癌细胞增殖侵袭的抑制作用

2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：贺佳陈韡靓宗荣荣张妮妮徐谨斐夏文乐毛宇彬厦门大学医学院基础部

目的:研究ErbB2酪氨酸激酶抑制剂GW2974与Hsp90抑制剂17aag联合应用对ErbB2稳定转染细胞株erbB2/MCF7的作用,寻找更为有效的治疗ErbB2高表达乳腺癌患者的治疗方法。方法:将erbB2基因导入ErbB2低表达的乳腺癌细胞株MCF7中,并使erbB2基因... 详细信息

目的:研究ErbB2酪氨酸激酶抑制剂GW2974与Hsp90抑制剂17aag联合应用对ErbB2稳定转染细胞株erbB2/MCF7的作用,寻找更为有效的治疗ErbB2高表达乳腺癌患者的治疗方法。方法:将erbB2基因导入ErbB2低表达的乳腺癌细胞株MCF7中,并使erbB2基因在MCF7细胞中稳定表达,即构建稳定转染细胞株erbB2/MCF7。将erbB2/MCF7细胞培养在10%FBS,1%双抗的1640培养基中,分别加药GW2974、

关键词： ErbB2 GW2974 17aag 乳腺癌

来源： cnki会议评论

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中华实验外科杂志 2011年第10期28卷 1623-1626页

作者：崔越宏吴伟忠刘天舒谢倩刘康达复旦大学中山医院肿瘤内科上海200032

目的观察17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17aag）对肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的抑制作用。方法检测1μmol／L17aag对细胞增殖、侵袭能力和凋亡的影响，观察0．1μmol／L和1．0μmol/L17aag对其靶点热休克蛋白（HSP）90表达... 详细信息

目的观察17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17aag）对肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的抑制作用。方法检测1μmol／L17aag对细胞增殖、侵袭能力和凋亡的影响，观察0．1μmol／L和1．0μmol/L17aag对其靶点热休克蛋白（HSP）90表达的影响。结果17aag对HL7702肝脏细胞无生长抑制作用，对肝母细胞瘤细胞HepG2[24、48和72hIC50值分别为（14182．94±6369．90）、（1．56±0．19）和（0．02±0．00）μmol／L]和肝癌细胞MHCC-97H[24、48和72h IC50值分别为（5660．49±3029．33）、（3．30±0．31）和（1．55±0．12）μmol／L]均有生长抑制作用，影响细胞周期，降低其离散和侵袭的能力，并诱导凋亡，对裸鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用，降低肿瘤的肺、肝转移。17aag上调HSP90的表达。结论17aag对HepG2细胞和MHCC-97H细胞具有增殖抑制、诱导凋亡和降低转移能力的作用，而对HL-7702肝脏细胞则无生长抑制及诱导凋亡的作用。

关键词：癌肝细胞热休克蛋白 17aag 增殖侵袭

Hsp90 inhibition induces destabilization of actin cytoskeleton in tumor cells:functional significance of Hsp90 interaction with F-actin

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Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2010年第9期3卷 715-722页

作者： Vishal Chaturvedi Amere Subbarao Sreedhar Centre for Cellular and Molecular Biology Uppal RoadHyderabad 500 007India

Objective:To examine the role of heat shock protein 90(Hsp90) in the maintenance of actin cytoskeleton in human neuroblastoma tumor ***:Co-precipitation experiments were performed to examine Hsp90 interaction with ***90 and actin interactions were evaluated by protein refolding and acto-myosin motility assays.17-(AUylamino)-17- demethoxygeldanamycin(17aag) induced actin-cytoskeleton re-organization was examined by laser scanning confocal ***:It was shown that inhibition of Hsp90 by 17AAC accelerates detergent induced cell lysis of neuroblastoma tumor cells through destabilization of actin *** in vitro co-precipitation experiments showed that functional but not mutant Hsp90 binds with *** biochemical modifications,phopshorylation and oligomerization enhanced Hsp90 binding with F-actin.F-actin binding to Hsp90 interfered with Hsp90 chaperone activity in protein refolding assays,and Hsp90 binding to F-actin interfered with actin motility on myosin coated flow *** the combination treatment,17aag irreversibly augmented the effect of cytochalasin D,an inhibitor of actin ***:It can be concluded that Hsp90 binds to F-actin in tumor cells and maintains the cellular integrity. The results display a novel element of Hsp90 inhibition in destabilizing the actin cytoskeleton of tumor cells,therefore suggest that 17aag combination with cytoskeletal disruptor may be effective in combating cancer.

关键词： Hsp90 F-actin Cytoskeleton 17aag Tumor cells Combination treatment

热休克蛋白90抑制剂对白血病细胞分化凋亡信号通路的作用

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中华血液学杂志 2007年第10期28卷 677-680页

作者：俞文娟饶青王敏田征徐智芳王建祥中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室浙江大学医学院第一附属医院杭州310003

目的探讨热休克蛋白(HSP)90抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17aag)诱导白血病细胞生长抑制、分化和凋亡作用的信号传导途径。方法采用不同剂量的17aag 处理Kasumi-1细胞,Western blot 检测处理前后 kit 蛋白(CD117)及其下游信号分... 详细信息

目的探讨热休克蛋白(HSP)90抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17aag)诱导白血病细胞生长抑制、分化和凋亡作用的信号传导途径。方法采用不同剂量的17aag 处理Kasumi-1细胞,Western blot 检测处理前后 kit 蛋白(CD117)及其下游信号分子 AKT、STAT3水平;免疫共沉淀法检测处理前后 HSP 与 kit 蛋白的结合状态变化。结果 17aag 降低突变 kit 蛋白及其活性水平,但并不影响 c-kit mRNA 水平;17aag 能降低组成性活化 kit 下游信号分子 AKT 及其磷酸化水平,同时磷酸化 STAT3水平亦降低,但总 STAT3水平没有变化;免疫共沉淀法检查结果显示经17aag 处理1 h 后,与 kit 结合的 HSP90明显减少,同时结合的 HSPT0增加。结论在诱导白血病细胞分化凋亡过程中,17aag 能降低 Kasumi-1细胞内 Asn822Lys 突变 kit 蛋白及其磷酸化水平,同时下调 kit 蛋白下游增殖及存活信号途径的信号分子;AKT 也是 HSP90的客户蛋白之一;17aag 所导致的 kit 蛋白与HSP90及 HSP70结合状态的变化,符合分子伴侣复合物的循环模型。

关键词：白血病急性 c-kit 突变 17aag HSP90抑制剂信号传导分子 AKT STAT3

17-(Allylamino)-17-Demethoxygeldanamycin Combination with Curcumin Selectively Targets Mitogen Kinase Pathway in A Human Neuroblastoma Cell Line

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Journal of Cancer Therapy 2010年第4期1卷 197-204页

作者： Taiyab Aftab Kuppa Srinivas Usha Subbarao Sreedhar Amere Centre for Cellular and Molecular Biology

Pharmacological inhibition of Hsp90 has emerged as a novel anticancer treatment. In this study we have investigated the effect of Hsp90 inhibitor drug 17aag combination with curcumin on human neuroblastoma cells. The 17aag treatment of cells for 18 h induced G1/S cell cycle arrest associated with cyclin D1 down regulation, and degradation of Raf-1 and inactivation of Akt. However, 17aag treatment activated the mitogen kinase, ERK1, and induced the expression of stress proteins, Hsp70 and p53. The curcumin treatment resulted in G2/M cell cycle arrest and activation of both Raf1 and ERK1 kinases. The drugs in combination induced proteolytic degradation of Raf1 and Akt, and surpassed curcumin induced G2/M arrest. The combination treatment additionally inactivated MEK, inhibited activation and nuclear localization of ERK1, and also inhibited the stress protein induction. EGF stimulation induced re-activation of mitogen signaling with individual drug treatments but not in combination. This study highlights that 17aag combination with curcumin selectively targets mitogen signal transduction mechanism through ERK1 inactivation. In conclusion, our study proposes the beneficial effects of 17aag combination with curcumin in combating cancer.

关键词： Hsp90 17aag Curcumin Neuroblastoma Combinatorial treatment

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HSP90靶向治疗后发性白内障的抑制研究

HSP90靶向治疗后发性白内障的抑制研究

作者：李梦园河南大学

学位级别：硕士

背景后发性白内障(Posterior capsular opacification,PCO)是白内障晶体囊外摘除术后最常见的并发症,是术后视力再次障碍的主要原因。PCO主要病理特征是残留晶状体上皮细胞发生增殖、迁移、上皮-间质转化、胶原沉积及晶状体纤维再生等... 详细信息

背景后发性白内障(Posterior capsular opacification,PCO)是白内障晶体囊外摘除术后最常见的并发症,是术后视力再次障碍的主要原因。PCO主要病理特征是残留晶状体上皮细胞发生增殖、迁移、上皮-间质转化、胶原沉积及晶状体纤维再生等。目前,手术方式的提高及人工晶体材料和设计的改进可以改善术后PCO的发生,但PCO的发生率并没有大幅度降低。现阶段治疗PCO唯一有效手段是Nd:YAG激光治疗,这种方法不仅治疗费用昂贵,且术后导致多种并发症,如晶体损伤、视网膜脱落、囊状黄斑水肿、眼内炎、角膜水肿、眼压升高、晶状体脱位或半脱位、晶状体凹陷等。目前,并没有治疗或预防PCO的药物安全应用于临床试验。我们研究发现热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)特异性抑制剂17aag能够抑制晶状体上皮细胞系增殖。HSP90是一种ATP依赖性分子伴侣,在蛋白稳定和降解中起着重要作用,抑制HSP90功能导致其靶蛋白降解。17aag是HSP90 N端抑制剂,能抑制HSP90和ATP的结合,从而抑制HSP90 ATP酶的活性,现处于临床II期研究。EGFR是HSP90的靶向蛋白,EGFR信号通路受HSP90调控,17aag能通过促进EGFR降解抑制其下游通路从而抑制细胞增殖。晶状体上皮细胞系是研究PCO最简单的实验模型,但未考虑细胞粘附在晶状体囊膜上的影响,未能真实反映PCO病理生理上的变化。因此,我们制备体外大鼠PCO囊袋模型和体内兔PCO模型,以探讨HSP90特异性抑制剂17aag对后发性白内障的抑制作用及分子机制。目的探讨HSP90特异性抑制剂17aag对后发性白内障的抑制作用及分子机制。方法1.制备体外大鼠晶状体PCO囊袋模型,通过免疫印迹实验检测无血清培养6h、12h、24h时和正常组织上皮细胞中HSP90、EGFR、p-ERK的表达量。2.使用小鼠晶状体上皮细胞系(m LEC)和人晶状体上皮细胞系(SRA01/04、HLE-B3),通过细胞增殖实验检测17aag对晶状体上皮细胞增殖的影响。3.制备大鼠PCO囊袋模型,通过培养和倒置显微镜观察,检测17aag对囊袋残留上皮细胞增殖的影响,并通过Ed U标记法验证其作用效果。4.制备大鼠PCO囊袋模型,通过免疫印迹实验检测17aag对囊袋残留上皮细胞中EGFR及下游通路表达的影响。5.制备大鼠PCO囊袋模型,通过TUNEL染色法和免疫印迹实验检测17aag是否诱导囊袋上皮细胞凋亡。6.制备大鼠PCO囊袋模型,通过培养和倒置显微镜观察,比较17aag和HSP90非N端抑制剂PEITC对囊袋残留上皮细胞增殖的影响,并通过Ed U标记法验证其作用效果。7.构建兔体内PCO模型,检测17aag对兔体内PCO发生的影响。结果1.大鼠晶状体囊袋残留上皮细胞高表达HSP90,EGFR信号通路激活。2.17aag抑制晶状体上皮细胞系增殖,且有时间和浓度依赖性。3.17aag抑制大鼠PCO囊袋模型组织上残留上皮细胞增殖。4.17aag促进囊袋残留上皮细胞中EGFR降解并抑制其下游通路。5.17aag诱导大鼠晶状体PCO囊袋上皮细胞发生凋亡。***90非N端抑制剂PEITC不抑制大鼠晶状体囊袋残留上皮细胞增殖。7.17aag延迟兔体内PCO的发生。结论***发生中HSP90表达升高,EGFR信号通路上调,并参与囊袋残留上皮细胞增生。2.17aag通过抑制HSP90-EGFR信号通路抑制大鼠囊袋残留上皮细胞增殖和兔PCO发生。***90是预防PCO的一个新的靶向分子。

关键词：后发性白内障 HSP90 17aag 表皮生长因子