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基于丝网印刷电极的电化学传感器在细菌16s rrna基因检测中的研究

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基于丝网印刷电极的电化学传感器在细菌16S rRNA基因检测中的研究

作者：吴立全南京邮电大学

学位级别：硕士

近年来,细菌感染引发的疾病导致全球公共卫生问题层出不穷,每年因细菌感染所导致的经济损失就高达数十亿美元。细菌感染不仅阻碍了社会经济的发展,更对人类的生命安全造成了威胁。因此,如何实现细菌感染源的早期发现以及快速确定细菌类... 详细信息

近年来,细菌感染引发的疾病导致全球公共卫生问题层出不穷,每年因细菌感染所导致的经济损失就高达数十亿美元。细菌感染不仅阻碍了社会经济的发展,更对人类的生命安全造成了威胁。因此,如何实现细菌感染源的早期发现以及快速确定细菌类型成为应对细菌感染的有效防治措施。细菌检测作为预防细菌感染的有效手段在环境监测、食品安全和医学诊疗等领域受到了人们的广泛关注。传统检测方法具有检测周期长、检测程序复杂、对样品要求高等缺点,严重制约着细菌感染的快速防治。因此,亟需发展新型、快速、低成本、高精度的检测技术,实现细菌感染的早期检测,从而有效遏制细菌感染的发生和扩散。电化学生物传感器因其低成本、简单、快速、灵敏度高和易于器件化等优点已成为当前细菌感染检测的重要手段之一,备受科研工作者的青睐。综上所述,本论文选用小型化、便携、易于功能化、可批量化生产的丝网印刷电极作为电极材料,以具有能够区分不同细菌种类的16s rrna基因片段作为研究对象,设计构建可高灵敏、特异性检测细菌的电化学生物传感器。本论文主要分为以下两个方面:1、构建了用于大肠杆菌16s rrna基因检测的电化学传感器。首先,采用电化学沉积法制备了金微纳米花状结构功能化丝网印刷电极(sPCE-Au NFs),提高丝网印刷电极的传导性。同时,通过化学合成方法一步合成了金纳米粒子和硫堇共功能化二硫化钼纳米复合材料(Mo s-Au NPs-Thi),作为纳米信号探针构筑材料。将两条标记有巯基的DNA1链和DNA2链通过Au-s键分别组装到sPCE-Au NFs电极和Mo s-Au NPs-Thi纳米复合材料上。大肠杆菌16s rrna基因存在时,电极表面形成经典的DNA1-16s rrna-DNA2三明治结构,实现对大肠杆菌16s rrna基因特异性识别与检测。最佳实验条件下,该传感器检测大肠杆菌16s rrna基因的浓度范围为10 f M-100 p M,其检测限为2.8 f M。研究表明该传感器还具有较好的稳定性和重现性,不仅可用于牛奶样品中16s rrna的高效检测,还可用于大肠杆菌裂解液中16s rrna基因高灵敏检测,进一步说明该传感器在实际样本检测中的应用前景。2、构建了用于金黄色葡萄球菌16s rrna基因检测的电化学传感器。通过引入新型基因编辑技术(CRIsPR/Cas系统),发展了CRIsPR-电化学联用技术用于实现细菌基因片段的高灵敏、快速检测。在金微纳米结构功能化的丝网印刷电极表面组装一端标记有巯基,另一端标记有二茂铁信号分子的颈环结构DNA探针,构建电化学传感界面。当金黄色葡萄球菌16s rrna基因加入后,其与crrna、Cas 12a蛋白形成三元复合物,激活了Cas 12a蛋白的切割活性,对电极表面的颈环结构DNA探针进行剪切,使二茂铁信号分子从电极表面脱离,导致电化学信号降低。通过监测电化学信号的变化,可以实现对金黄色葡萄球菌16s rrna基因的检测。最佳实验条件下,该传感器的峰电流降低值与金黄色葡萄球菌16s rrna基因在10 p M-100 n M范围内呈良好的线性关系,其检测限为2.0 p M。该传感器还具有较好的稳定性和重现性,可用于牛奶样本中金黄色葡萄球菌16s rrna基因的高灵敏检测。

关键词：细菌检测电化学生物传感器丝网印刷电极 16s rrna

基于16s rrna分析对癫痫患儿肠道菌群变化的探讨

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基于16S rRNA分析对癫痫患儿肠道菌群变化的探讨

作者：张万花南方医科大学

学位级别：硕士

研究目的:(1)研究癫痫患儿和健康儿童的肠道菌群差异。(2)探究某些特殊菌群与癫痫的关系。研究方法:收集2021年7月1日至2022年10月31日在南方医科大学附属佛山妇幼保健院儿科一区住院治疗的初次确诊癫痫、未使用抗癫痫药物的患儿60例以... 详细信息

研究目的:(1)研究癫痫患儿和健康儿童的肠道菌群差异。(2)探究某些特殊菌群与癫痫的关系。研究方法:收集2021年7月1日至2022年10月31日在南方医科大学附属佛山妇幼保健院儿科一区住院治疗的初次确诊癫痫、未使用抗癫痫药物的患儿60例以及该院儿童保健科常规体检的健康儿童(部分为该院职工健康的子女)30例粪便标本,提取总DNA然后进行扩增,通过16s rrna测序技术来鉴定微生物的种类,利用生物信息学方法分析肠道菌群的差异。采用sPss 26.0软件对试验数据进行统计学分析。研究结果:(1)在α多样性方面,癫痫患儿组faith pd指数为31.70±14.98,Chao1 指数为 270.99±152.94,observed features 指数为 270.42±152.50,shannon 指数 4.47±1.26,simpson 指数为 0.89(0.79,0.94),健康儿童组分别为 26.54±8.73、223.49±105.77、223.07±105.50、4.10±0.83、0.85(0.79,0.90),两组中仅有faithpd指数的差异有统计学意义(P=0.042)。(2)在β多样性方面,Bray Curtis指数、Unweighted Unifrac指数和Weighted Unifrac指数差异均有统计学意义(P值分别为0.006、0.034、0.007)。主成分分析表明,第一主成分的解释度是14.910%,第二主成分的解释度是7.431%,第三主成分的解释度是6.390%,组成结构的差异具有统计学意义(F=2.208;P=0.005)。(3)与健康儿童组相比,癫痫患儿组肠道菌群结构存在紊乱。在门水平,癫痫患儿组的厚壁菌门丰度显著富集(P=0.023),健康儿童组的变形菌门显著富集(P=0.023);在纲水平,健康儿童组的丙型变形菌纲丰度显著高于癫痫患儿组(P=0.040);科水平及属水平中,癫痫患儿组的韦荣氏菌科及巨球型菌属显著富集(P值分别为0.048、0.0006)。(4)健康儿童组菌群人类疾病、细胞过程、环境信息处理、膜运输、细胞群落--原核生物通路显著富集;而癫痫患儿组在丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢通路显著富集(P均served features指数均较发作次数≥4次的癫痫患儿高(P值均s指数、Unweighted Unifrac指数有统计学意义(P值分别为0.001、0.005),主成分分析结果显示,两组的第一主成分解释度是16.340%,第二主成分的解释度是7.575%,第三主成分的解释度是6.349%,组成结构的差异有统计学意义(F=2.305;P=0.003)。(7)在肠道菌群的各水平上,发作次数stridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、TM7 纲梭菌目(Clostridiales)毛螺菌科(Lachnospiraceae)、布劳特氏菌属(Blautia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、粪球菌属(Coprococcus)显著富集,假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)在发作次数≥4次的癫痫患儿组显著富集(P值均<0.05)。癫痫发作次数≥4次组的L-异亮氨酸及L-谷氨酰胺生物合成通路较发作次数<4次组降低。研究结论:(1)与健康儿童组相比,癫痫患儿组存在致病菌增多以及潜在的有益菌群减少,在丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢通路显著富集,不同癫痫发作次数分组的肠道菌群分布也存在差异,并且存在不同程度的生物合成受损。(2)癫痫患儿组韦荣氏菌科、巨球型菌属较健康儿童组富集,此两种菌种有可能与癫痫发病相关。

关键词：肠道菌群癫痫儿童脑肠轴 16s rrna

应用16s rrna基因测序技术分析早期抗生素暴露对极早产儿肠道菌群变化的影响

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应用16S rRNA基因测序技术分析早期抗生素暴露对极早产儿肠道菌群...

作者：张金铃贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:应用16s r RNA基因测序技术动态监测极早产儿在出生后第1天、3天、1周、1月、3月肠道菌群变化规律,探索早期抗生素暴露对极早产儿肠道菌群定植及演变过程影响,为极早产儿救治过程中规范使用抗生素提供临床依据。方法:选取2021年11... 详细信息

目的:应用16s r RNA基因测序技术动态监测极早产儿在出生后第1天、3天、1周、1月、3月肠道菌群变化规律,探索早期抗生素暴露对极早产儿肠道菌群定植及演变过程影响,为极早产儿救治过程中规范使用抗生素提供临床依据。方法:选取2021年11月1日-2022年4月30日贵州医科大学附属医院产科出生,且收治于新生儿科生后24小时内使用抗生素治疗的20例极早产儿(胎龄16s r RNA基因测序技术对粪便标本进行一系列肠道菌群生物信息学分析。使用Qiime2软件和R软件进行Alpha多样性、Beta多样性分析,LEf se做菌群差异分析,Bugbase进行肠道菌群表型预测,运用sPss 26.0软件进行统计分析,采用Fisher’s exact test对无生物学重复样品差异比较;Mann-Whitney U test对有生物学重复两组样品差异比较;Kruskal-Wallis test对有生物学重复样品的多组之间比较。结果:1.极早产儿肠道菌群多样性分析:肠道菌群扩增子序列变异体(amplicon sequence variants,AsV)数目、Chao1指数及shannon指数从生后第3天开始下降,随着抗生素的停用及日龄的增加有所恢复,但3月龄时仍不能恢复至生后第1天的水平。PCo A分析及NMDs分析显示5个时间点的样品基本可区分开来,UPGMA分析显示在同一研究对象不同时点肠道菌群相似性不高。2.极早产儿肠道菌群组成与相对丰度变化:(1)共测得44个门,占粪便样本微生物总数90%以上的主要有4个门,包括变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门,极早产儿肠道菌群菌门变化特点为变形菌门相对丰度先增加后减少、厚壁菌门相对丰度先减少后增加,放线菌门在生后处于稳定的低丰度状态,3月时迅速增加;(2)共测得1041个属,菌属演替依次为明串珠菌属、克雷伯菌属、双歧杆菌属。极早产儿住院期间,1月内克雷伯菌属占据绝对优势地位,双歧杆菌属处于稳定的低丰度状态,随着抗生素的停用及日龄的增加,3月时克雷伯菌属相对丰度急剧下降,双歧杆菌属相对丰度急剧增高,占比最大(24.20%)成为优势菌属。3.极早产儿肠道菌群表型预测:(1)刚出生时最先定植的是需氧菌和兼性厌氧菌,生后第3天需氧菌降低,兼性厌氧菌增加,厌氧菌定植不稳定,3月时厌氧菌和兼性厌氧菌成为优势菌群。(2)早期抗生素暴露极早产儿特定表型的肠道菌群相对丰度表现为先增加后降低,即1月龄时达峰值后急剧降低,包括生物膜形成、潜在致病性、含移动元素表型以及革兰氏阴性表型肠道菌群,且多在变形菌门出现。结论:1.极早产儿生后24小时内抗生素暴露会降低肠道菌群的丰富度及多样性,随着抗生素的停用及日龄的增加,肠道菌群的丰富度及多样性有所恢复。2.NICU住院的极早产儿从生后第3天开始以变形菌门、克雷伯菌属为优势菌,抗生素治疗使其相对丰度增加,停用抗生素后逐渐降低,3月时双歧杆菌属剧增成为优势菌属。3.极早产儿最先定植的是需氧菌和兼性厌氧菌,从生后第3天开始,需氧菌减少、厌氧菌增加,3月时厌氧菌和兼性厌氧菌成为优势菌群。

关键词：极早产儿胎龄抗生素肠道菌群 16s rrna

面向微生物16s rrna序列的聚类与分类预测算法研究

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面向微生物16S rRNA序列的聚类与分类预测算法研究

作者：张佳桂林理工大学

学位级别：硕士

微生物与人类的生活息息相关,测序技术的发展使得微生物宏基因组学跨入新的发展时期,基于高通量技术扩增的生物学实验产生了大量16s r RNA（16s ribosomal RNA）序列信息,对产生的16s r RNA序列进行数据分析是生物信息学上一项严峻的挑... 详细信息

微生物与人类的生活息息相关,测序技术的发展使得微生物宏基因组学跨入新的发展时期,基于高通量技术扩增的生物学实验产生了大量16s r RNA（16s ribosomal RNA）序列信息,对产生的16s r RNA序列进行数据分析是生物信息学上一项严峻的挑战,其中一项主要的技术就是将16s r RNA序列进行聚类,从而分析环境中菌群物种丰度及多样性。目前,已经存在很多种不同的聚类算法,且均可实现有效聚类,因此,宏基因组学的研究者人员需要更多地考虑聚类算法的效率问题,其次,需要考虑如何更精准地通过已知16s r RNA序列的分类水平来推测未知序列的分类类别。本文的主要研究内容如下:（1）针对K-means算法参数随机初始化的情况,本文考虑到网格聚类算法及密度聚类算法相结合带来的优势,结合K-means++算法的思想策略,提出一种基于网格密度距离的K-means优化算法,并在聚类操作前对16s r RNA序列数据使用主成分分析法进行特征值提取,将维度降低,易于数据处理及可视化分析。优化后的算法在样本数量较大的数据集中,实现了初始聚类中心的稳定选取,同时减少了聚类迭代次数,提高了聚类稳定性。（2）本文提出基于优化鸽群的ELM极限学习机的序列预测方法,主要针对数据库中没有的16s r RNA序列信息,通过机器学习构建模型来预测16s r RNA序列所属分类。神经网络模型通过学习大量16s r RNA序列数据的排列信息便可以做到高预测精度的分类预测。考虑到极限学习机具有较高的学习准确性和较低的运行时间,但是随机生成的输入层权重和偏置传播到隐含层解析出的输出矩阵若为非满列秩矩阵时,算法会出现计算问题。鸽群算法存在的问题是在地图和指针算子模型运算过程中,鸽群全部向位置较好的个体移动,容易陷入局部最优,对此引入遗传算法中交叉机制使鸽群巡航跳出局部最优。针对地标算子每次迭代都将鸽群数量减半,容易导致种群多样性降低,并且过早收敛,利用柯西变异来优化地标算子,提高种群多样性。将改进后的鸽群算法用于ELM网络模型的参数进行优化,提升极限学习机网络的性能,提高预测精度。

关键词： 16s rrna 聚类 K-means 极限学习机

应用16s rrna基因序列鉴定15只鸟类残体

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中国法医学杂志 2023年第6期38卷 702-704页

作者：朱弘曹件生尚素微杨柳李贺鹏浙江省林业科学研究院浙江杭州310023 浙江省林科院司法鉴定中心浙江杭州310023 浙江省湿地研究中心浙江杭州310023

目的应用鸟类线粒体16s rrna基因PCR测序方法进行涉案鸟类残体的物种鉴定。方法以15只未知鸟类残体冷冻肌肉组织为研究材料,采用PCR扩增DNA条形码片段16s rrna。结果通过序列在线比对和系统发育分析,判定15份检材涉及珠颈斑鸠(spilop... 详细信息

目的应用鸟类线粒体16s rrna基因PCR测序方法进行涉案鸟类残体的物种鉴定。方法以15只未知鸟类残体冷冻肌肉组织为研究材料,采用PCR扩增DNA条形码片段16s rrna。结果通过序列在线比对和系统发育分析,判定15份检材涉及珠颈斑鸠(spilopelia chinensis)、斑鸫(Turdus eunomus)、麻雀(Passer montanus)、金翅雀(Chloris sinica)、燕雀(Fringilla montifringilla)和北红尾鸲(Phoenicurus auroreus),共计6种鸟类物种,隶属2目6科6属,均为“三有名录”保护动物。结论 16s rrna基因片段可以作为一个可靠手段对鸟类残体进行准确的物种鉴定,为司法案件的定性与量刑提供可靠的证据。

关键词：鸟类残体 DNA条形码 16s rrna 分子鉴定

基于16s rrna基因的葛根芩连汤对放射性肠炎小鼠肠道菌群调节作用的基础研究

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基于16S rRNA基因的葛根芩连汤对放射性肠炎小鼠肠道菌群调节作用...

作者：张思萌辽宁中医药大学

学位级别：硕士

目的:建立急性放射性肠炎小鼠模型,采用16s r RNA测序技术研究葛根芩连汤对放射性肠炎小鼠肠道菌群的调节作用,为葛根芩连汤的临床应用提供理论及实验依据。材料与方法:将41只sPF级的雄性BALB/c小鼠按照体重排序随机分成六组,分别为空... 详细信息

目的:建立急性放射性肠炎小鼠模型,采用16s r RNA测序技术研究葛根芩连汤对放射性肠炎小鼠肠道菌群的调节作用,为葛根芩连汤的临床应用提供理论及实验依据。材料与方法:将41只sPF级的雄性BALB/c小鼠按照体重排序随机分成六组,分别为空白对照组(6只)、模型对照组(7只)、低剂量葛根芩连汤组(7只)、中剂量葛根芩连汤组(7只)、高剂量葛根芩连汤组(7只)及蒙脱石散组(7只)。每组小鼠给予sPF级饲料及纯净水喂养,饲养一周后,建立急性放射性肠炎小鼠模型。造模前小鼠禁食24h,除空白对照组不予以照射处理,其余五组小鼠麻醉后,采用6MV高能X线直线加速器进行11Gy单次全腹部照射。各组均于照射后次日开始灌胃,空白对照组和模型对照组均给予0.9%生理盐水0.5ml灌胃,低、中、高剂量葛根芩连汤组分别给予0.25g/ml、0.75g/ml、1.25g/ml浓度葛根芩连汤0.5ml灌胃,蒙脱石散组给予0.05g/ml浓度蒙脱石散混合液0.5ml灌胃,每日一次,共给药一周。期观察小鼠体质量、排便情况及自由活动度等一般情况,记录每日DAI评分。一周后收集每只小鼠的新鲜粪便,于-80℃超低温冰箱冻存,通过16s r RNA高通量测序,分析和比较各组小鼠肠道菌群的构成、丰富度及多样性。采集小鼠血液进行内毒素(ET)检测,留取各组小鼠小肠组织,分成两部分,一部分进行常规切片HE染色,光镜下观察小肠组织的形态学改变,另一部分做组织匀浆,进行一氧化氮(NO)检测。结果:1.小鼠一般情况观察:照射后各组小鼠均出现不同程度的饮食饮水量下降、体质量减轻、软便、肛周不洁、弓背、毛发凌乱及蜷缩少动等表现,照射后第6天开始有所改善。2.小鼠体质量分析结果:照射后第1天,各组小鼠体质量未见明显差异(P>0.05)。与空白对照组相比其余五组小鼠体质量在照射后第2-5天内明显下降,第6天开始略有回升,具有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,模型对照组小鼠体内的NO含量显著增多,结果具有统计学意义(P0.05)。6.16s r RNA高通量测序结果:在门分类水平上,各组的优势菌门为厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria。与空白对照组相比,模型对照组中厚壁菌门(28.42±13.18)、拟杆菌门(28.12±7.70)丰度降低,有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,葛根芩连

关键词：葛根芩连汤放射性肠炎肠道菌群 16s rrna

黄芩汤治疗蓖麻油致小鼠腹泻的作用及机制研究

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中草药 2024年第5期55卷 1590-1599页

作者：陈文露彭新宇康桦华潘育方唐兴刚蒋顺进黄炜乾丁焕中黄婷徐志宏广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640 惠东县人民医院广东惠州516399 广东药科大学广东广州510006 广东容大生物股份有限公司广东清远511517 华南农业大学广东广州510642 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225

目的研究黄芩汤对蓖麻油致小鼠腹泻模型的作用及作用机制。方法昆明小鼠随机分为对照组、模型组、洛哌丁胺(5 mg/kg)组和黄芩汤高、中、低剂量(20、10、5 g/kg)组,每组10只。连续3 d ig给药,末次给药30 min后ig 0.5 mL蓖麻油制备腹泻模... 详细信息

目的研究黄芩汤对蓖麻油致小鼠腹泻模型的作用及作用机制。方法昆明小鼠随机分为对照组、模型组、洛哌丁胺(5 mg/kg)组和黄芩汤高、中、低剂量(20、10、5 g/kg)组,每组10只。连续3 d ig给药,末次给药30 min后ig 0.5 mL蓖麻油制备腹泻模型。测定腹泻评分和腹泻指数,采用qRT-PCR检测肝脏中α-1-酸性糖蛋白(alpha 1-acid glycoprotein,AGP)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、转铁蛋白(transferrin,TRF)、白蛋白(albumin,ALB)和小肠中水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)、AQP4、Na/H离子交换器2(Na/H exchanger 2,NHE2)、NHE3、NHE8 mRNA表达;采用免疫组化法和Western blotting检测小肠中AQP3和NHE8蛋白表达;收集肠道内容物,进行16s rrna测序。结果黄芩汤显著降低小鼠的腹泻评分和腹泻指数(Ps和Candidatus_Arthromitus丰度,降低厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值。结论黄芩汤可能通过下调肠上皮转运蛋白和急性期蛋白表达,改变肠道菌群,从而减轻蓖麻油引起的腹泻。

关键词：黄芩汤 16s rrna 腹泻肠上皮转运蛋白急性期蛋白肠道菌群芍药苷黄芩苷黄芩素汉黄芩苷甘草酸铵

基于16s rrna测序的驯鹿肠道菌群结构分析

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基于16S rRNA测序的驯鹿肠道菌群结构分析

作者：杨卿内蒙古农业大学

学位级别：硕士

驯鹿(Rangifer tarandus)是偶蹄目、反刍亚目、鹿科、驯鹿属下唯一的动物,体型中等,雌雄均生茸角,别名角鹿。驯鹿主要分布于环北极圈地带的针叶林中,栖息地土壤贫瘠、植被稀少、气候寒冷,主要采食北极地带的苔藓、石蕊,也食用蘑菇和木... 详细信息

驯鹿(Rangifer tarandus)是偶蹄目、反刍亚目、鹿科、驯鹿属下唯一的动物,体型中等,雌雄均生茸角,别名角鹿。驯鹿主要分布于环北极圈地带的针叶林中,栖息地土壤贫瘠、植被稀少、气候寒冷,主要采食北极地带的苔藓、石蕊,也食用蘑菇和木本植物的嫩枝,且苔藓和地衣是驯鹿维持生存不可或缺的食物。经长期的自然选择驯鹿进化出许多独特的生物学性状,如耐寒性、抗逆性较强、食性独特、不耐粗饲。我国驯鹿主要分布于大兴安岭西北部根河及周边区域,处于半野生状态,由鄂温克族土著猎民长期驯养,即可役用,又为其提供了营养丰富的肉、乳、茸角等,成为当地具有较高经济价值与生态价值的畜种。肠道微生物是定植在宿主体内的微生物群体,参与调控宿主代谢、免疫、内分泌等多种生理过程。动物肠道菌群的组成是其在栖息地长期生存、与环境相互作用、进化的结果,其与宿主的遗传、食性、发育过程等密切相关,在维持机体健康生长发育过程中起到关键的作用。肠道微生物与宿主之间的相互作用非常复杂,已有大量对人类及其他一些经济动物的肠道菌群的研究报道,但至今尚未有对驯鹿肠道菌群结构的相关研究。为此本文以驯鹿为研究对象,采集其粪便和肠道内容物,经传统菌种分离培养并结合16s rrna高通量测序技术对其肠道菌群结构进行研究,分析其肠道菌群的组成特征,为了解肠道菌群组成与驯鹿独特生物学行为与性状形成的相关性奠定必要的基础。主要研究结果如下:1.驯鹿肠道菌群多样性较其他鹿科动物丰富,菌群组成独特。9个驯鹿粪便中肠道菌群共涉及到58个细菌门;在门、纲、目、科不同分类阶层中的核心菌依次为:厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria);梭菌纲(Clostridia)和拟杆菌纲(Bacteroidia);拟杆菌目(Bacteroidales)和颤螺菌目(Oscillospirales)及颤螺菌科(Oscillospiraceae)。2.不同生境下的驯鹿粪便菌群结构有显著差异。非产地人工饲养驯鹿有1955个独特AsVs,自然栖息地半驯养驯鹿有5142个独特AsVs,两组共同拥有383个AsVs。人工饲养驯鹿粪便中厚壁菌门(Firmicutes)丰度较高,自然栖息地半驯养驯鹿粪便中蓝细菌门(Cyanobacteria)丰度较高,表明驯鹿肠道菌群组成会受到饮食条件的影响。3.驯鹿消化道不同部位的菌群结构有显著差异。驯鹿肠道内容物中丰度最高的5个菌属分别是泛生菌属(Pantoea)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Unidentified＿Clostridiales、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)和欧文氏菌属(Erwinia);粪便中丰度最高的5个属分别是Chloroplast、UCG-005、拟杆菌属(Bacteroides)、Mitochondria和Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group。4.驯鹿肠道菌群组成会受到栖息地气候温度的影响。与居于热带温暖环境中的海南坡鹿相比,驯鹿肠道菌群中拟杆菌门丰度显著降低,该门细菌在动物体内可代谢碳水化合物产生丙酸盐等短链脂肪酸,减少脂肪储存,其丰度减少或更利于寒冷环境下驯鹿机体能量的保存。综上所述,通过16s rrna测序技术结合各类统计分析方法,本研究明确了驯鹿肠道菌群的组成特点,发现驯鹿肠道菌群多样性较为丰富,其菌群组成受到饮食、气候条件的显著影响。这些研究结果为后续揭示驯鹿肠道菌群组成与其独特食性、抗寒性之间的关联机制提供了重要的依据。

关键词：驯鹿 16s rrna 肠道菌群优势菌群

宏条形码分子标记12s rrna和16s rrna在哺乳动物混合检材种源鉴定中的应用

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宏条形码分子标记12S rRNA和16S rRNA在哺乳动物混合检材种源鉴定...

作者：刘元峰山东大学

学位级别：硕士

种源鉴定（species identification）在食品药品安全和法医物证鉴定领域中有重要价值,其中常见哺乳动物检材鉴定问题发生最为频繁。然而常规方法,如普遍使用的DNA条形码技术,均不能解决混合检材、腐败降解检材等特殊检材的种源鉴定问题... 详细信息

种源鉴定（species identification）在食品药品安全和法医物证鉴定领域中有重要价值,其中常见哺乳动物检材鉴定问题发生最为频繁。然而常规方法,如普遍使用的DNA条形码技术,均不能解决混合检材、腐败降解检材等特殊检材的种源鉴定问题。本研究选取8个哺乳动物代表材料,设计了 12s rrna和16s rrna宏条形码,基于高通量测序技术,初步建立起一种基于Miseq高通量测序平台鉴定混合物种的方法。针对二代测序技术无法实现物种成分定量问题,论文探讨使用荧光定量PCR技术进行补充,为常见哺乳动物检材鉴定提供技术参考。种源鉴定研究结果如下:（1）使用12s rrna和16s rrna基因特有引物进行PCR扩增和sanger测序,结果表明PCR扩增效率为100%;测序峰图干净无杂峰,测序成功率为100%。单独使用12s rrna和16s rrna测序序列经GenBank 比对,与数据库已有序列相似度均在98%以上,表明这两个标记均可准确鉴定种源信息。使用DNA条形码方法进行鉴定,序列在构建的邻接树上的物种分辨度为100%。（2）样本DNA等浓度混合后的混合样品稀释成不同梯度浓度（3 ng/μL、0.3ng/μL、0.03 ng/μL）,使用两对通用引物扩增后进行二代测序建库和基于Miseq平台的二代测序。经质控去除低质量序列,双端序列拼接后12s rrna共获得196309条reads,其序列平均长度为391bp;16s rrna共获得144952条reads,其序列平均长度为408bp。将获得的序列汇总在OTU中,目标物种在12s rrna扩增样本中相对丰度占比最高为梅花鹿（Cervus nippon）29.49%,最低为人（Homo sapiens）3.18%。在 16s rrna 扩增样本中相对丰度占比最高为梅花鹿（Cervus nippon）26.47%,最低为小家鼠（Mus musculus）0.82%。而混合样品的各物种的浓度比例均相同,说明二代测序在种源物种成分定量分析存在局限。在非目标物种中,相对丰度占比最高为12s rrna的黇鹿（Dama dama）0.1055%和16s rrna的加拿大马鹿（Cervus canadensis）0.01281%。采用MP进行系统发育树的构建,发现非目标物种与目标亲缘关系较近,推测为序列库比对错误的结果。为此在本方法中,可将样品检测灵敏度的阈值设为0.5%,以减少非目标物种对种属鉴定的影响,这样可使二代测序检测方法的鉴定结果更为可靠。（3）采用实时荧光定量PCR方法测定检材DNA浓度的下限,以测定12s rrna和16s rrna通用引物的灵敏性。研究表明,各样本在浓度梯度下（1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001ng/μL）的Ct值均小于35,而人和鼠的样本在1pg/μL的12s rrna扩增结果中,人和鼠的平均Ct值为35.872和36.759;在1pg/μL的16s rrna扩增结果中人和鼠的平均Ct值为35.209和35.177,均大于35。其余样本Ct值在0.1pg/μL浓度下大于35。说明本研究中该引物的通用检测阈值在0.001ng/μL。针对二代测序技术中样本序列相对丰度与实际含量不能建立比例关系问题,本研究对二代测序物种中单一样品对应浓度的扩增曲线进行分析,发现6个物种可以通过扩增曲线进行荧光定量,但在同样浓度下人和鼠的样本扩增效率不如其他物种,与二代测序结果中人和鼠的相对丰度最低一致,推测二代测序中物种的相对丰度与引物扩增效率有关。综上所述,研究针对线粒体12s rrna和16s rrna基因区段设计通用宏条形码引物,采用sanger测序、Miseq高通量测序和荧光定量PCR技术评估两对高通量测序分子标记的有效性,初步建立了一种基于Miseq高通量测序平台鉴定混合物种的方法,并针对二代测序技术无法实现样本成分定量问题补充荧光定量PCR技术进行分析。因此本研究开发的鉴定方法可为常见哺乳动物检材鉴定提供技术参考。

关键词：高通量测序技术宏条形码种源鉴定 12s rrna 16s rrna