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水稻根系细菌的高通量分离及其功能研究

水稻根系细菌的高通量分离及其功能研究

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作者：张万源华中农业大学

学位级别：硕士

水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一,其高产、稳产维系粮食安全。在自然界中,植物根系附着大量微生物,这些微生物对于促进植物正常生长、提高养分吸收效率、诱导系统抗性和提高抗逆性等方面发挥着重要作用。深入解析水稻与根系细菌... 详细信息

水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一,其高产、稳产维系粮食安全。在自然界中,植物根系附着大量微生物,这些微生物对于促进植物正常生长、提高养分吸收效率、诱导系统抗性和提高抗逆性等方面发挥着重要作用。深入解析水稻与根系细菌的有益互作机制,有助于利用根系细菌调节生长、减少病害以及提高抗逆,有助于促进农业微生物资源的合理利用,促进农业的可持续发展。为了解析水稻根系细菌促进水稻健康生长的功能机制,从水稻根系中分离培养特定生态位的细菌就显得至关重要。本研究旨在利用多种培养技术和方法对水稻根系细菌进行分离培养,收集水稻根系细菌核心资源,构建水稻根系细菌资源库。同时,基于生物发光的Firefly luciferase(Fluc)和Nanoluciferase(Nluc)报告系统由于其快速简便的优点,构建了水稻双报告基因系对分离培养细菌进行快速功能筛选。根据报告基因的响应程度筛选有益细菌并进一步探究细菌功能。取得的主要结果如下:1.通过利用96孔细胞培养板极限稀释的高通量分离培养方法和传统的细菌分离培养方法从水稻根系中对细菌进行分离培养,已初步完成水稻根系细菌资源库的构建。(1)高通量分离培养目前共保存96孔细胞培养板122板,平均每个96孔板中有40%的孔含有细菌培养物,共获得了约4500个细菌培养物。此外,本研究已完成其中首批14板(编号ZH1～ZH14)细菌分离物的16s r RNA基因的扩增和测序,共鉴定了397个细菌培养物。(2)利用不同类型的固体培养基进行分离培养,发现R2A培养基上生长的菌落数量最多,且不同培养基上生长的细菌形态各不相同。对平板生长菌落进行连续拾取并保存,目前共计保存细菌培养物1816份,已全部完成测序鉴定。综合两种策略分离培养细菌已覆盖水稻根系细菌(相对丰度大于0.1%)的50%,主要包括变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门4大门类。2.利用双报告基因系可快速筛选影响水稻基础免疫和营养吸收的细菌。本研究对前期构建的双报告基因系进行了验证,该报告系含PR5基因驱动的Nanoluciferase(Nano Luc)和UBI10启动子表达Firefly luciferase(Fluc)。将四种不同细菌接种PR5::Nano Luc水稻后,利用Nluc/Fluc的比值筛选到这些细菌都可能调控PR5基因的表达。并通过定量RT-PCR验证了报告基因系筛选的结果。利用同样的策略,我们鉴定到另外OTU54、ZHBC88、ZHBC112三个细菌能抑制NRT1.1B的表达。以上结果证明利用水稻报告系快速筛选细菌功能的可行性。3.为了验证分离细菌的功能和定殖,我们对降解生长素的益生菌OTU54进行了进一步的分析。将OTU54进行GFP荧光标记后,我们确定了OTU54能够定殖于水稻根内,并观察到在根尖富集。携带GFP标记的OTU54并不影响其降解生长素的能力。同时OTU54与另外两株能够产生生长素的根瘤菌菌株M15和B27的对峙培养结果显示,OTU54与M15、B27之间并没有拮抗关系。综上所述,本研究通过多种培养方法对水稻根系细菌进行了高通量培养,构建了水稻根系细菌资源库,为进一步水稻根系细菌与水稻的互作研究提供了丰富的菌株材料。验证了水稻报告基因系可以快速进行细菌功能筛选,为快速获取有益细菌提供了新方法。确定了OTU54在水稻根系的定殖部位,为进一步功能研究奠定了基础。

关键词：水稻分离培养根系细菌 16s-seq 报告基因

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