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高效甾体15α-羟化毕赤酵母重组菌的构建及高密度发酵研究

高效甾体15α-羟化毕赤酵母重组菌的构建及高密度发酵研究

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作者：曾玉龙天津科技大学

学位级别：硕士

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成高效避孕药孕二烯酮的关键中间体。工业上用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)生产15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的工艺存在底物投料量低(2‰)、转化效率不高、废水处理压力大等缺点。为提高左旋... 详细信息

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成高效避孕药孕二烯酮的关键中间体。工业上用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)生产15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的工艺存在底物投料量低(2‰)、转化效率不高、废水处理压力大等缺点。为提高左旋乙基甾烯双酮的投料量,建立更高效、绿色环保的转化体系,本课题选择毕赤酵母(GS115)作为表达宿主,构建高效的双酮15α-羟化反应体系。研究内容如下:(1)在毕赤酵母中过表达雷斯青霉15α-羟化酶基因PRH,获得重组菌株15134;为进一步提高底物双酮转化率和投料量,在异源表达PRH的基础上共表达酿酒酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1,获得重组菌株Z15134;通过摇瓶和5 L发酵罐转化比较重组毕赤酵母菌株Z15134和15134的转化效率。(2)选择高效重组菌在5 L发酵罐中进行高密度发酵,监控菌体生长情况和底物的投料量。(3)对高密度发酵的最终产物进行液相分析;以摇瓶发酵菌体作对照,对上罐发酵的菌体进行转录组测序分析。结果显示:(1)重组菌Z15134和15134摇瓶双酮转化显示,在投料量为1‰的情况下,菌株Z15134底物完全转化时间缩短了12 h。(2)重组毕赤酵母Z15134和15134在5 L发酵罐投料量1‰情况下,重组菌Z15134底物转化效率明显高于对照菌15134。(3)重组菌Z15134进一步在5 L发酵罐中进行双酮转化,发酵时间为196 h,底物投料量最终为10‰,产物浓度为5.79±0.18 g/L,OD为276.8±1.39。(4)对上罐发酵和摇瓶发酵菌株Z15134进行转录组测序,进行差异表达基因GO和KEGG pathway功能富集分析,通过q RT-PCR定量对转录组测序结果进行验证准确。本文通过在毕赤酵母中共过表达雷斯青霉15α-羟化酶和酿酒酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,获得高效重组毕赤酵母菌株Z15134,并利用高密度发酵成功建立了底物投料量提高400%的15α-羟双酮生产工艺。

关键词：左旋乙基甾烯双酮毕赤酵母高密度发酵转录组测序 15α-羟化酶

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