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高效液相体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量及疫苗质量评估

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中国农业科学 2019年第20期52卷 3695-3704页

作者：朱元源徐嫄邹兴启杨延丽刘丽丽万建青李翠徐璐张乾义夏应菊王兆郎洪武王琴张松平赵启祖中国兽医药品监察所中国科学院过程工程研究所/生化工程国家重点实验室

【背景】口蹄疫疫苗质量评价方法对疫苗生产企业和监管部门进行质量控制尤为重要,146s抗原含量是评价口蹄疫疫苗质量的关键指标。蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient centrifugation,sDGC)是公认经典的测定口蹄疫146s抗原含... 详细信息

【背景】口蹄疫疫苗质量评价方法对疫苗生产企业和监管部门进行质量控制尤为重要,146s抗原含量是评价口蹄疫疫苗质量的关键指标。蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient centrifugation,sDGC)是公认经典的测定口蹄疫146s抗原含量的方法,但存在检测耗时长、过程复杂、重复性差等缺点,影响了疫苗的质量监测。口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量高效液相体积排阻色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography, sE-HPLC)是一种简便、快速、自动化程度高、高效的测定方法。【目的】在初步建立的采用sE-HPLC测定口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量方法的基础上,针对不同类型、不同浓缩纯化生产工艺制备的口蹄疫灭活疫苗,进一步确认sE-HPLC法在检测过程中的普适性势在必行。【方法】利用口蹄疫146s抗原标准品建立sE-HPLC法标准曲线,求得回归方程,用于检测样品的146s含量。采用sE-HPLC法和sDGC法分别检测146s抗原标准品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀释的5个样品和市场上随机选取的22批疫苗,计算146s抗原含量,对比分析两种方法的相关性。用sE-HPLC法,3次重复检测不同企业生产的134批口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量,通过色谱图特异性、检测值相对标准偏差(relative standard deviation,RsD)分析sE-HPLC法的重复性,评价该方法的适用性,分析市场流通疫苗的总体质量情况。【结果】sE-HPLC法建立的标准曲线,峰面积与146s抗原含量的线性关系良好(R2=0.9981,n=8)。口蹄疫146s抗原标准品5个稀释样品和22批口蹄疫疫苗的146s抗原含量检测结果表明,口蹄疫146s抗原含量检测sDGC法和sE-HPLC法高度正相关(Rs2=0.9994,ns=5;Rv2=0.9602,nv=22)。134批口蹄疫灭活疫苗中,146s抗原含量相对标准偏差RsD146s抗原含量相对标准偏差RsD≤10%的疫苗批次占疫苗总批次(134批)的97.76%。口蹄疫146s抗原含量sE-HPLC法检测重复性良好,其中疫苗146s抗原含量2—4μg·mL-1时,检测重复性最好。所有批次疫苗均检测到目的峰,目的峰的平均起峰、最高峰、落峰时间分别为sE-HPLC法进样后的11.58、12.90、14.93min,平均持续3.36min。134批口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量为1.11—80.36μg·mL-1,其中单价苗、双价苗、双组分苗、三价苗146s抗原含量均值分别为2.07、2.40、2.85、13.14μg·mL-1。【结论】口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量sE-HPLC法适用性好、重复性高、高效、快速、简便,能够用于检测不同类型的口蹄疫灭活疫苗,从而进行疫苗的质量监测和评估。市场流通的口蹄疫灭活疫苗146s含量较高,疫苗质量较好。

关键词：高效液相体积排阻色谱法口蹄疫灭活疫苗 146s 疫苗质量

高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146s抗原含量的疫苗破乳方法比较

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中国兽药杂志 2020年第2期54卷 22-28页

作者：徐嫄王兆朱元源李翠邹兴启朱利敏万建青王琴郎洪武夏应菊徐璐张乾义赵启祖中国兽医药品监察所北京100081

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146s抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破... 详细信息

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146s抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破乳后水相得率分别为:正戊醇38%~49%,正丁醇42%~44%,三氯甲烷50%;9批疫苗的色谱结果均检测到146s特征峰,146s含量在0.7~12.5μg/mL,3次测定的相对标准偏差最大值为4.0%,9批疫苗不同前处理方法的检测结果均值具有统计学意义,三氯甲烷组与正戊醇组数据一致性强,正丁醇组测定值偏低。使用三氯甲烷对疫苗进行破乳,不仅操作简便快速,而且破乳水相得率稳定,是最优的破乳方法。实验进一步优化了口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量检测的高效体积排阻色谱法,为该方法的科学应用提供了数据支撑。

关键词：口蹄疫灭活疫苗 146s 高效体积排阻色谱破乳

应用高效体积排阻色谱法测定市场抽检口蹄疫灭活疫苗中的抗原(146s)含量

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中国兽药杂志 2018年第1期52卷 7-12页

作者：徐嫄邹兴启刘晓东李翠朱元源李阳万建青何天慈徐璐张乾义王琴郑金来赵启祖中国兽医药品监察所北京100081 北京市动物疫病预防控制中心北京102629 北京标驰泽惠生物科技有限公司北京102600

应用高效体积排阻色谱法对5批市场抽检口蹄疫灭活疫苗中有效抗原(146s)含量进行检测,并使用口蹄疫O型、A型和亚洲1型抗原测试卡对5批疫苗中的抗原进行鉴别。结果显示高效体积排阻色谱法测定146s标准品浓度与峰面积线性关系良好,5批疫苗... 详细信息

应用高效体积排阻色谱法对5批市场抽检口蹄疫灭活疫苗中有效抗原(146s)含量进行检测,并使用口蹄疫O型、A型和亚洲1型抗原测试卡对5批疫苗中的抗原进行鉴别。结果显示高效体积排阻色谱法测定146s标准品浓度与峰面积线性关系良好,5批疫苗均检测到146s特征吸收峰(R2=0.9937,n=7),经计算得到灭活疫苗中有效抗原含量分别为2.05、3.73、2.03、4.87、3.41μg/m L;使用抗原测试卡鉴别了5批疫苗中的抗原类型。结果表明,高效体积排阻色谱法简便、高效,准确度较高,有望在口蹄疫灭活疫苗的质量控制中发挥重要作用。

关键词：高效体积排阻色谱口蹄疫灭活疫苗 146s

蔗糖密度梯度法定量口蹄疫完整病毒粒子(146s)的特异性研究

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中国兽药杂志 2012年第11期46卷 6-8页

作者：刘玉梅刘飞孙艳琪张立华董俊余赵丽霞范秀丽刘国英卢永干金宇保灵生物药品有限公司呼和浩特010030 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

为验证蔗糖密度梯度法检测口蹄疫完整病毒粒子(146s)的特异性,选择pH值6.0、5.0、4.0 PBs酸解处理3批提纯后的146s灭活抗原液,并将酸解后样品进行146s检测,发现8至11级份OD259峰值消失,146s含量由酸解前的1.77、6.60、3.67μg/mL至酸解... 详细信息

为验证蔗糖密度梯度法检测口蹄疫完整病毒粒子(146s)的特异性,选择pH值6.0、5.0、4.0 PBs酸解处理3批提纯后的146s灭活抗原液,并将酸解后样品进行146s检测,发现8至11级份OD259峰值消失,146s含量由酸解前的1.77、6.60、3.67μg/mL至酸解后完全不能检测到。同时对3批不含病毒的细胞液按抗原纯化灭活工艺处理后进行146s检测,结果显示3批细胞液在8至11级份均没有明显吸收峰,而且其OD259值与PBs空白对照OD259值基本平行一致,说明不含病毒的细胞液对检测结果没有明显干扰。试验证明,蔗糖密度梯度法定量FMD病毒液中146s含量具有很好的特异性。

关键词： FMDV 146s 蔗糖密度梯度紫外光测量特异性

对多种口蹄疫疫苗有效抗原(146s)、总蛋白、内毒素三者含量测定的比较研究

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国外畜牧学（猪与禽） 2013年第6期33卷 79-81页

作者：林新仁福建农林大学动物科学学院福建福州350002 厦门国寿种猪开发有限公司福建厦门361100

对市场上流行使用几种口蹄疫灭活疫苗进行有效146s抗原、总蛋白及内毒素含量测定,同时对疫苗破乳后的水相进行了sDs-PAGE分析。不同疫苗的质量差异极其显著,有效146s抗原含量从未检出至8.53μg/头剂;总蛋白含量从未检出至4 325μg/头剂... 详细信息

对市场上流行使用几种口蹄疫灭活疫苗进行有效146s抗原、总蛋白及内毒素含量测定,同时对疫苗破乳后的水相进行了sDs-PAGE分析。不同疫苗的质量差异极其显著,有效146s抗原含量从未检出至8.53μg/头剂;总蛋白含量从未检出至4 325μg/头剂;内毒素含量从0.55至15.65 EU/头剂。运用sDs-PAGE、Western bolt技术分析表明各种疫苗所含杂蛋白含量及有效抗原量差异较大。部分疫苗的有效146s抗原含量不足,非抗原蛋白含量较大,大多数国产疫苗146s含量与非抗原蛋白之比在0.3%以下,这是造成很多口蹄疫疫苗免疫过程产生的副作用及免疫失败的主要原因之一。

关键词：口蹄疫疫苗总蛋白 146s 内毒素

O、A、Asia 1型口蹄疫病毒胶体金定量检测免疫层析方法的建立

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畜牧兽医学报 2021年第4期52卷 1042-1052页

作者：李昕孙燕燕林密陈夏辉李峰松包艳芳杨光蒋韬中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

旨在建立口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)抗原血清型的快速分型和定量的检测方法,利用双抗体夹心法,将口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗体作为标记胶体金与NC膜检测带的原料,分别制备出检测O、A、Asia 1血清型的3种层析试纸卡... 详细信息

旨在建立口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)抗原血清型的快速分型和定量的检测方法,利用双抗体夹心法,将口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗体作为标记胶体金与NC膜检测带的原料,分别制备出检测O、A、Asia 1血清型的3种层析试纸卡。通过对标定的抗原标准品146s检测,拟合出定量标准曲线。免疫层析方法的质量验证通过特异性、敏感性、重复性及与蔗糖密度梯度法(sucrose density gradient, sDG)的相关性进行评价。结果显示:建立的快速定量检测方法,3种血清型口蹄疫病毒间无交叉反应,同时与其他非口蹄疫病毒,如塞内卡病毒A型(sVA)、猪水疱病病毒(sVDV)、猪水疱性口炎病毒(VsV)无非特异反应;敏感性研究,对O、A、Asia 1型病毒的最低检出量分别为0.567、0.693、0.219μg·mL^(-1),拟合的3条标准曲线的线性相关系数R~2>0.97,新建立方法与蔗糖密度梯度法检测结果的相关系数均>0.9, 3种层析试纸卡的变异系数均小于10%。综上表明,建立的口蹄疫O、A、Asia1型病毒胶体金免疫层析定量检测试纸卡方法,可以用于口蹄疫病毒抗原快速鉴别、血清分型与146s定量检测。

关键词：口蹄疫病毒胶体金免疫层析定量检测 146s

BHK-21悬浮细胞培养条件筛选及口蹄疫病毒悬浮培养工艺研究

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黑龙江畜牧兽医 2022年第18期 119-129页

作者：施程洪陆礼琼李彦荣吴海燕段春平李应福赵路路兰虎云彭正啟王继华刘术新中普生物制药有限公司云南保山678000

为了实现在幼地鼠肾细胞(BHK-21细胞)低血清全悬浮培养工艺下获得更高含量的口蹄疫病毒(FMDV),试验对比了4株不同来源的BHK-21悬浮细胞的培养特性,按体积1%、2%和5%分别接种O型、A型FMDV,接种后4,8,12,16,20,24小时取样进行146s、半数... 详细信息

为了实现在幼地鼠肾细胞(BHK-21细胞)低血清全悬浮培养工艺下获得更高含量的口蹄疫病毒(FMDV),试验对比了4株不同来源的BHK-21悬浮细胞的培养特性,按体积1%、2%和5%分别接种O型、A型FMDV,接种后4,8,12,16,20,24小时取样进行146s、半数致死量(LD)对比研究,筛选形态良好、培养特性更稳定的BHK-21悬浮细胞株;以摇瓶悬浮培养筛选得到的BHK-21悬浮细胞株,使用O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株,从接种剂量、活细胞密度(VCD)、病毒培养温度、病毒培养pH值、换液体积比例等工艺参数对病毒146s表达的影响进行了研究,并在7.5,50,500 L生物反应器中逐级放大,进行了O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株各3个批次病毒液悬浮培养研究,确定O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株接种BHK-21悬浮细胞的培养工艺。结果表明:筛选得到1株形态良好、培养特性更稳定的BHK-21-CP005悬浮细胞株;O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株在摇瓶低血清悬浮培养的BHK-21-CP005悬浮细胞株中增殖的最适条件为,当细胞培养48 h, VCD达4.5×10~6/mL,按体积2%接种O/HB/HK/99株和AF/72株,培养温度为36.5~37.0℃,pH值为7.30~7.50,按4∶5体积比例换液,接种病毒16~20 h后收获病毒液,病毒146s含量不低于9.0μg/mL,LD不低于1×10/0.2 mL。说明使用BHK-21-CP005株低血清全悬浮培养生产更高含量的FMDV工艺稳定,可以实现规模化生产。

关键词：口蹄疫病毒 BHK-21 低血清反应器悬浮培养 146s 半数致死量

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口蹄疫病毒完整病毒粒子定量方法的研究进展

中国畜牧兽医 2012年第9期39卷 82-85页

作者：刘艳霞张贵刚金宇保灵生物药品有限公司内蒙古呼和浩特010030

口蹄疫疫苗的有效抗原成分为完整的口蹄疫病毒粒子(146s),疫苗的效力与疫苗中含有的146s具有极大的相关性。因此对疫苗的生产过程及产品进行146s的定量检测是非常重要的环节。目前对146s定量的方法主要是超速离心的方法,除此之外,ELIsA... 详细信息

口蹄疫疫苗的有效抗原成分为完整的口蹄疫病毒粒子(146s),疫苗的效力与疫苗中含有的146s具有极大的相关性。因此对疫苗的生产过程及产品进行146s的定量检测是非常重要的环节。目前对146s定量的方法主要是超速离心的方法,除此之外,ELIsA检测也越来越受到关注,同时很多研究人员也在积极探索其他更为简便快捷的检测方法。作者主要对各种146s的定量方法作一综述。

关键词：口蹄疫疫苗口蹄疫病毒 146s

Asia Ⅰ型口蹄疫抗原单抗ELIsA检测方法建立及疫苗种毒的分子鉴定

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Asia Ⅰ型口蹄疫抗原单抗ELISA检测方法建立及疫苗种毒的分子鉴定

作者：张怀宇中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

采用蔗糖密度梯度离心法纯化灭活AsiaⅠ型(新疆毒株)口蹄疫病毒146s抗原，免疫BALB／C小鼠，融合脾细胞与sP2／0骨髓瘤细胞，使用间接夹心ELIsA方法筛选，获得4株可稳定分泌抗AsiaⅠ型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定，其中... 详细信息

采用蔗糖密度梯度离心法纯化灭活AsiaⅠ型(新疆毒株)口蹄疫病毒146s抗原，免疫BALB／C小鼠，融合脾细胞与sP2／0骨髓瘤细胞，使用间接夹心ELIsA方法筛选，获得4株可稳定分泌抗AsiaⅠ型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定，其中1GC、2GB、10CG细胞培养上清抗体效价可达1：20000以上，腹水抗体效价可达1：10以上;8EC细胞培养上清抗体效价也可达1：5，120以上，腹水抗体效价可达1：81，920以上。四株单抗的亚型分别是1GC、8EC、10CG均为IgG亚类;2GB为IgM亚类。经sDs-PAGE和免疫组化染色确定1GC、2GB、10CG单抗针对构象型表位，而8EC单抗针对线型表位。其中8EC腹水单抗不纯，需要进行亚克隆，以提高纯度。四株单抗均有中和能力，其中8EC单抗中和能力最弱。均具有很好的型特异性。以上述1GC、2GB、10CG单抗的混合抗体为基础，建立了间接夹心ELIsA方法。使用该方法测定了AsiaⅠ型病毒灭活抗原、O型病毒灭活抗原、正常BHK细胞培养液，结果表明该方法特异性好，所测定OD值和AsiaⅠ型抗原稀释倍数呈明显线性关系。采用该方法对11批AsiaⅠ型、O型单价或双价成品疫苗破乳抗原进行了测定，结果表明不同批次不同企业生产的疫苗完整病毒颗粒抗原含量有差异，进一步完善有望用于成品AsiaⅠ型口蹄疫疫苗中有效颗粒抗原含量的测定，从而发展成为一种疫苗效力检验替代方法。采用RT-PCR技术，扩增测定了制苗种毒(新疆株和LC株)VP1基因序列，对生产企业制苗种毒进行了“身份”鉴定，结果表明各企业均以规程批准的制苗毒株生产疫苗。同时与我国目前AsiaⅠ型主要流行毒株(江苏株)VP1核苷酸序列及推导氨基酸序列进行了比较，结果表明，新疆株对江苏株的核苷酸同源性为84.4％，氨基酸同源性为89.6％;LC株与江苏株的核苷酸同源性为84.4％，氨基酸同源性为90.0％;新疆株与LC株的核苷酸同源性为83.4％，氨基酸同源性为87.2％。通过对两个疫苗毒株的VP1基因及推导氨基酸序列的分析，发现两个疫苗株与流行株(江苏株)不属于同一基因型(VP1核苷酸序列同源性＞85％为同一基因型)，新疆株和LC株的VP1G-H环140～160位氨基酸和羧基端203～211位氨基酸残基内的分别有9个、7个变异位点，但两者的RGD基序均未发生改变，其利用整联蛋白途径来识别宿主细胞位点能力也未发生变化。因此使用这两个疫苗种毒株制备出的疫苗能否完全保护当前主要流行毒株(江苏株)，还有待进一步的研究。

关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体 146s 间接夹心ELIsA RT-PCR