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缺氧对小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及成骨分化影响的研究

缺氧对小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及成骨分化影响的研究

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作者：王许巧兰州大学

学位级别：硕士

目的:观察1%o缺氧环境对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养、增殖、迁移及成骨分化的影响并探讨相关分子机制。方法:(1)小鼠BMSCs的体外培养:选择全骨髓贴壁法分离小鼠原代细胞,分别于1%o和21%o条件下... 详细信息

目的:观察1%o缺氧环境对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养、增殖、迁移及成骨分化的影响并探讨相关分子机制。方法:(1)小鼠BMSCs的体外培养:选择全骨髓贴壁法分离小鼠原代细胞,分别于1%o和21%o条件下纯化、培养细胞,在显微镜下观察、记录细胞的形态和增殖情况;(2)1%o和21%o条件下小鼠BMSCs分别向成骨样、成脂样和成神经样细胞方向诱导分化:将P3代的小鼠BMSCs用成骨样细胞诱导液、成脂样细胞诱导液以及成神经样细胞诱导液分别诱导培养14,21和3天,在显微镜下观察记录细胞形态和增殖分化状况,然后将成骨样细胞用茜素红染液染色、成脂样细胞用油红o染液染色、成神经样用细胞尼氏染色液染色鉴定;(3)流式细胞术鉴定1%o和21%o组小鼠BMSCs:选取P3代的1%o和21%o组小鼠BMSCs,待细胞长至80%-90%融合度时,制备成单细胞悬液,上机检测Sca-1、CD29、CD117、CD45表面分子标记物;(4)1%o和21%o组小鼠BMSCs的检测指标:CCK-8法检测各组小鼠BMSCs 1到7天的增殖情况,制作增殖曲线;细胞划痕实验检测1%o和21%o组小鼠BMSCs在0h,6h,12h,24h和48h的细胞迁移效率;Mito Tracker染色后荧光显微镜观察不同培养条件下线粒体结构和形态的变化,并用流式细胞术检测荧光强度;将1%o和21%o组细胞均用成骨诱导液连续诱导3,5,7,10和14天,检测上清液中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,并在成骨诱导液诱导14天后茜素红染色,在显微镜下观察成骨效率,同时,用氯化十六烷基吡啶溶解钙结节进行半定量检测;Seahorse细胞代谢能量分析仪检测各组细胞耗氧率(oxygen consumption rate,oCR);Western blot检测成骨相关基因Run相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨桥蛋白的(osteopontin,oPN)表达。结果:(1)选用全骨髓贴壁法获得的小鼠BMSCs,在1%o和21%o条件下培养均为纺锤形、多角形克隆样生长的细胞;(2)小鼠BMSCs经过成骨诱导液、成脂诱导液以及成神经诱导液的条件分化后,三组染色结果均为阳性,分别观察到明显的红色矿化结节、红色脂滴和深紫色尼氏小体;(3)流式细胞分析鉴定结果显示在1%o和21%o条件下培养获得的细胞,Sca-1、CD29表达均为阳性,而CD117、CD45表达均为阴性;(4)细胞增殖实验结果显示,在1%o和21%o条件下培养获得的细胞,其增殖效率第1、2天时两组之间无显著性差异,第3天至第7天时1%o组的细胞增殖效率明显高于21%o组;细胞划痕实验表明,与21%o组相比,1%o可明显促进细胞迁移效率;Mito Tracker染色后发现1%o组线粒体结构形态较21%o组成熟,呈短棒状,连接成网状,流式结果表明1%o组Mito Tracker染色荧光强度明显强于21%o组;茜素红染色发现1%o组钙结节明显多于21%o组;碱性磷酸酶检测表明第7天1%o组ALP活性表达明显高于21%o组;Seahorse检测结果表明1%o组oCR高于21%o组;Western blot结果表明1%组BMSCs的成骨相关蛋白RUNX2和oPN表达明显高于21%o组,且以上结果均具有统计学差异(p1%o和21%o条件下获得的小鼠原代细胞均为具有干细胞特征的骨髓间充质干细胞,然而,缺氧条件下获得的小鼠BMSCs具有更高的增殖效率和迁移效率,同时缺氧条件下培养的小鼠BMSCs具有更高的成骨分化效率,且分化效率与细胞线粒体结构形态及线粒体耗氧率结果保持一致。

关键词：小鼠骨髓间充质干细胞 1%o2 成骨分化线粒体 Seahorse

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