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蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的实时荧光定量PCR检测

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江苏农业科学 2023年第15期51卷 21-28页

作者：宋起萱浦艳飞余蓉培瞿素萍杨春梅吴丽芳汪国鲜阮继伟云南大学资源植物研究院云南昆明650504 云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心云南昆明650205 玉溪云星生物科技有限公司云南玉溪653100

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV... 详细信息

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV的外壳蛋白(coat protein,简称CP)基因片段进行克隆和序列比对,随后设计特异性引物,分别构建2种病毒的RT-qPCR(real time quantitative PCR,简称RT-qPC)检测体系,并对云南地区20份样品进行检测。研究结果显示,CymMV和ORSV CP基因序列与其他地区分离物中这2种病毒的核苷酸序列相似性分别为97.92%~98.66%和99.12%~99.56%,其CP基因序列具有保守性。CymMV和ORSV在RT-qPCR体系中最低检出浓度分别为30.9、35.0 copies/μL,灵敏度较RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,简称RT-PCR)提高10倍。利用RT-qPCR体系对20份温室样品进行检测,CymMV阳性率为100%,ORSV阳性率为90%,阳性率均高于RT-PCR检测结果。本研究构建的CymMV和ORSV RT-qPCR检测体系将为蝴蝶兰病毒病早期监测和脱毒种苗的培育奠定基础。

关键词：蝴蝶兰建兰花叶病毒齿兰环斑病毒实时荧光定量PCR 病毒检测

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齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

中国病毒学 2006年第1期21卷 64-67页

作者：明艳林郑国华李梅厦门华侨亚热带植物引种园国家农作物国外引种隔离检疫基地福建厦门361002

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,ORSV)。通过摩擦接种6科27种(或品种)指... 详细信息

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,ORSV)。通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月。提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体。SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa。该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物。用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究。

关键词：卡特兰鉴定抗血清齿兰环斑病毒

齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2010年第4期36卷 375-380页

作者：章颉孟春梅荣松张超洪健吴建祥浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所浙江杭州310029 浙江传化生物技术有限公司浙江杭州311231

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组... 详细信息

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础.

关键词：齿兰环斑病毒原核表达多克隆抗体 dot-blot ELISA 免疫捕获RT-PCR

齿兰环斑病毒CP基因的原核表达及其产物抗血清制备

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中国农学通报 2011年第19期27卷 115-120页

作者：罗金水吴祖建谢联辉福建农林大学植物病毒研究所福州350002 福建省热带作物科学研究所福建漳州363001

本研究在于探讨侵染兰花的重要病毒之一齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)CP基因的原核表达及其产物抗血清制备技术。从福建省漳州市采集感染齿兰环斑病毒的建兰病样,设计一对特异性引物扩增并克隆得到该病毒的外壳蛋白... 详细信息

本研究在于探讨侵染兰花的重要病毒之一齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)CP基因的原核表达及其产物抗血清制备技术。从福建省漳州市采集感染齿兰环斑病毒的建兰病样,设计一对特异性引物扩增并克隆得到该病毒的外壳蛋白基因,该基因开放阅读框长477bp,编码158aa约合18.0kDa的蛋白质,随后将目的基因插入pET-29a(+)中构建相应的原核表达载体进行诱导表达,目的蛋白经纯化后免疫家兔获得了特异性抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ORSV外壳蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附检测结果表明,抗血清可检测阳性病汁液的最低稀释度达1:25600(v/v),最佳工作浓度为1:12800(v/v),阳性病汁液灵敏度为0.195mg/mL(w/v),而与TMV等11种同源或异源病毒均无明显的血清学交叉反应。

关键词：齿兰环斑病毒外壳蛋白原核表达抗血清

齿兰环斑病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

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植物病理学报 2019年第1期49卷 20-26页

作者：万晴姣刘倩李欲轲龚记熠张宇斌乙引洪鲲贵州师范大学生命科学学院贵阳550001 贵州省植物生理与发育调控重点实验室贵阳550001

采用RT-PCR法从感染齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)贵州分离物的苋色藜叶片中扩增出病毒的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果显示,该保守片段长516bp,编码171个氨基酸残基。构建了该片段的原核表达载体pET32a-ORSV RdRp并转化BL21(DE3)菌株,在25℃以0.4mmol·L^(-1)IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为36 kDa,与预测相符合。将该重组蛋白作为抗原免疫BABL/C小鼠,制备的多克隆抗体效价达1∶102 400。间接ELISA结果表明,该多抗具有较强的特异性,能检测到ORSV感染的病叶汁液中的RdRp,而与其它感染4种同属或不同属病毒的病叶汁液不发生血清学交叉反应,本实验为进一步研究RdRp的结构和功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定基础。

关键词：齿兰环斑病毒 RdRp 原核表达多克隆抗体

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齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

植物保护 2008年第6期34卷 65-69页

作者：闻伟刚谭钟崔俊霞陈先锋宁波出入境检验检疫局宁波315012

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4... 详细信息

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明:普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100%的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。

关键词：齿兰环斑病毒建兰花叶病毒巢式RT—PCR 免疫捕获RT-PCR 检测灵敏度

复合感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构观察及病原物快速鉴定

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分子细胞生物学报 2007年第2期40卷 153-163页

作者：施农农徐莺王慧中谢礼洪健杭州师范大学生命与环境科学学院生化与分子生物学杭州市重点实验室杭州310036 浙江大学生物技术研究所杭州310029

通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病叶中线状和杆状病毒颗粒。组织切片观察,同时发现两种病毒粒子的典型聚集体:线状粒子的带状聚集体,粒子多层排列,层间呈一定角度或螺旋相叠;杆状粒子的平行、角层状或螺旋型排... 详细信息

通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病叶中线状和杆状病毒颗粒。组织切片观察,同时发现两种病毒粒子的典型聚集体:线状粒子的带状聚集体,粒子多层排列,层间呈一定角度或螺旋相叠;杆状粒子的平行、角层状或螺旋型排列聚集体。二种病毒聚集体均出现于薄壁细胞、细胞间隙和输导组织细胞中。感病细胞中叶绿体发育不全;线粒体增生、肿胀甚至空化;细胞核膨大、空化。进一步的多重RT-PCR与病毒核酸序列分析,同时扩增到建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的外壳蛋白基因,与GenBank已知分离物同源性分别达到98%和99%-100%。从细胞和分子层面揭示了蝴蝶兰受CymMV和ORSV复合侵染并可能导致严重病症的事实,分析和明确了感病兰细胞超微结构的病变特征以及田间病症发生的细胞病理学依据。

关键词：蝴蝶兰细胞超微结构多重RT-PCR 建兰花叶病毒齿兰环斑病毒复合感染

电化学发光反转录聚合酶链式反应技术检测齿兰环斑病毒

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分析化学 2006年第8期34卷 1087-1090页

作者：唐亚兵邢达刘晋峰朱德斌华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室广州510631

发展高效的病毒检测技术已成为当今生物学研究的热点之一。本研究将反转录聚合酶链式反应(PCR)技术与电化学发光分析方法结合起来,用于检测兰花中齿兰环斑病毒。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交,可起到筛选特异性产物的作... 详细信息

发展高效的病毒检测技术已成为当今生物学研究的热点之一。本研究将反转录聚合酶链式反应(PCR)技术与电化学发光分析方法结合起来,用于检测兰花中齿兰环斑病毒。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交,可起到筛选特异性产物的作用,从而避免假阳性结果的产生。三联吡啶钌标记探针与PCR产物杂交,既可以起到进一步筛选目的片段的作用,又可与分析液中的三丙胺反应,从而产生光信号,被电化学发光仪所检测到。在引物的5′端分别连接一段特异性核酸序列,既提高了钌探针与特异性产物的杂交几率,又增强了样品检测信号,从而提高了信躁比。实验结果表明:此方法灵敏度高、稳定性好、操作简单,可以从兰花样品中准确地检测到齿兰环斑病毒,有望发展成为一种高效的病毒检测方法。

关键词：电化学发光齿兰环斑病毒三联吡啶钌

江苏省建兰齿兰环斑病毒的鉴定和遗传多样性分析

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植物保护学报 2019年第4期46卷 745-753页

作者：吴伟文贺振刘娴李良俊扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009

为防控江苏省建兰上的齿兰环斑病毒(Odontoglossum ring spot virus,ORSV),采用酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)和反转录-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对采自江苏省扬州市的16份具有典型感染ORSV病害症状的建兰叶片样品进行检测鉴定,并结合GenBank中已报道的相关序列对其进行多样性和系统发育树分析。结果显示,扬州市建兰上ORSV检出率高达100%;所获得的ORSV分离物与GenBank中其它141个分离物的核苷酸序列一致率均在94%以上,所有ORSV分离物只能形成1个分组,且组内多样性水平低,不具备典型的寄主和地理特异性;6个ORSV种群间差异较小,种群多态性均较低,其中ORSV印度尼西亚种群的种群多态性最高,为0.025,ORSV德国种群和ORSV印度尼西亚种群之间的遗传距离最高,为0.0244。表明不同地区、不同寄主种群ORSV分离物的遗传差异很小,种群内不同分离物有很高的相似性。

关键词：建兰齿兰环斑病毒序列分析系统发育分析