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中国人兽共患病杂志 2003年第3期19卷 119-122页

作者：高志刚邹全明第三军医大学临床微生物及免疫学教研解放军第467医院重庆400038 第三军医大学临床微生物及免疫学教研室

大部分病毒、细菌引起的感染发生在胃肠道、呼吸道及生殖道等粘膜表面,疫苗注射免疫虽然可产生较强的系统免疫反应,但对粘膜感染无保护作用.

关键词：鼻粘膜免疫研究进展免疫机理特点反应机制疫苗研究

细菌外膜囊泡包被纳米给药系统的构建及其小鼠鼻粘膜免疫研究

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细菌外膜囊泡包被纳米给药系统的构建及其小鼠鼻粘膜免疫研究

作者：胡慧冰华东理工大学

学位级别：硕士

基于细菌外膜囊泡(OMV)的天然免疫原性,卵清白蛋白(OVA)作为一种常用的模型抗原蛋白,PLGA生物相容性和可降解性好。本课题构建了 OMV包被的载OVA纳米粒(NP)给药系统,并用于小鼠鼻粘膜免疫的研究,为构建新型的鼻粘膜疫苗传递系统奠定基... 详细信息

基于细菌外膜囊泡(OMV)的天然免疫原性,卵清白蛋白(OVA)作为一种常用的模型抗原蛋白,PLGA生物相容性和可降解性好。本课题构建了 OMV包被的载OVA纳米粒(NP)给药系统,并用于小鼠鼻粘膜免疫的研究,为构建新型的鼻粘膜疫苗传递系统奠定基础。选用大肠杆菌DH5α为模型菌株,超滤浓缩法制备该菌OMV。通过透射电镜(TEM)观察OMV的形态,SDS-PAGE分析蛋白组分,Bradford、BCA分析方法测量蛋白浓度,鲎试剂(LAL)分析内毒素量。结果表明,超滤浓缩法制备的OMV为球形囊泡且无鞭毛、细胞碎片等杂质,粒径为152.3±1.8 nm,Zeta电位为-28.5±2.19 mV。OMV提取液的蛋白浓度为2.46mg/mL,内毒素量为5.7×103EU/mg。采用纳米沉淀法制备PLGANP,机械挤出法制备OMV包被PLGANP(OMV-PLGA NP)。以粒径和Zeta电位为评价指标,优化OMV-PLGANP制备条件。通过TEM表征形态,SDS-PAGE分析各蛋白表达,LAL测定内毒素含量,考察纳米粒长期稳定性和血清稳定性。选用OVA为模型蛋白,乳化溶剂挥发法制备载OVA的PLGA纳米粒(OVA@PLGA NP),采用单因素法优化OVA@PLGA NP制备条件。机械挤出法制备OVA@OMV-PLGANP。结果表明,OMV-PLGANP形态为壳核结构,其Zeta电位、蛋白表达及内毒素含量与OMV相近。在磷酸缓冲盐(PBS)或胎牛血清(FBS)两种介质中OMV-PLGA NP稳定性要明显强于PLGA NP和OMV。OVA@PLGA NP粒径为311.6±1.62 nm,Zeta 电势为-20.4±2.04 mV,载药率为 5.2%,TEM 观察表明OVA@OMV-PLGANP为壳核结构。OMV包被的载药纳米粒通过Balb/c小鼠鼻腔给药(OVA剂量25μg/只,OMV剂量15μg/只),给药7天和14天后,用ELISA法酶联检测小鼠血液中IgG抗体滴度或鼻腔灌洗液、空肠、粪便中特异性sIgA抗体滴度。结果表明,给药7天时,与OVA、OVA@PLGANP、OMV、OMV-PLGANP、OMV+OVA、OMV+OVA@PLGANP 给药组相比,OVA@OMV-PLGA NP给药组小鼠血液中IgG抗体滴度最高;给药14天时,OVA@OMV-PLGANP给药组在鼻腔灌洗液、空肠及粪便中OMV-sIgA、OVA-sIgA抗体滴度最高;与OMV+OVA给药组相比,OVA@OMV-PLGA NP给药组在鼻腔灌洗液、空肠粘膜及粪便中,OVA-sIgA抗体滴度分别提高了 1.6倍、2.1倍和1.7倍,而OMV-sIgA抗体滴度均提高了 1.5倍;与OMV+OVA@PLGANP给药组相比,OVA@OMV-PLGANP组OMV-sIgA抗体滴度分别提高了 1.2倍,1.1倍和1.1倍,说明OMV-PLGANP载体能同时使OMV和OVA被摄取与呈递,产生最强的免疫诱导反应

关键词：细菌外膜囊泡鼻粘膜免疫疫苗卵清白蛋白纳米递药系统

重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达

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重庆医科大学学报 2006年第4期31卷 470-473页

作者：杨春何永林伊正君李俊明李娜朱道银重庆医科大学基础医学院微生物学教研室重庆400016

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法:将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pUV15)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB/c小鼠后2周,处死小鼠,观察肺、脾... 详细信息

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法:将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pUV15)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB/c小鼠后2周,处死小鼠,观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布;将携带GLS和IL-12质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB/C小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果:在BALB/c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论:携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布;携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后,可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础。

关键词：绿色荧光蛋白 GLS IL-12 耻垢分枝杆菌鼻粘膜免疫

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抗幽门螺杆菌不同免疫途径免疫奶羊的研究

营养学报 2005年第2期27卷 159-162页

作者：袁聚祥武英张天哲徐应军张铁民马立人华北煤炭医学院预防医学系唐山063000 唐山钢铁公司医院华北煤炭医学院微生物与免疫教研室唐山063000

目的:以幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,***,Hp)全菌抗原免疫奶羊,观察羊奶中特异性抗体产生规律。方法:采用菌液浓度为60亿cfu/ml全菌抗原,通过滴鼻、多点皮下注射、妊娠期肌肉注射三种途径免疫3只产奶山羊。前两组都于0、14、21、28d... 详细信息

目的:以幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,***,Hp)全菌抗原免疫奶羊,观察羊奶中特异性抗体产生规律。方法:采用菌液浓度为60亿cfu/ml全菌抗原,通过滴鼻、多点皮下注射、妊娠期肌肉注射三种途径免疫3只产奶山羊。前两组都于0、14、21、28d接受四次免疫接种,妊娠组于分娩前后1个月每隔2w注射1次。收集血清、乳清样本,以酶联免疫吸附试验测定IgA、IgG抗体。结果:经滴鼻、多点皮下注射、妊娠期肌注三种途径免疫奶羊后产生了抗体。血清中IgA变化幅度不大,三组血清中IgG较免疫前都有很大升高。羊奶中IgA抗体较免疫前都有升高,抗体水平:滴鼻组>妊娠组>皮下组,羊奶中IgG抗体水平:妊娠组IgG>皮下组>滴鼻组。结论:滴鼻粘膜免疫、多点皮下注射、妊娠期肌肉注射三种途径都能激发奶羊机体的免疫应答,使羊奶中抗Hp-IgA、抗Hp-IgG抗体水平升高,血清中IgG抗体水平升高,尤其是滴鼻免疫能够诱导机体同时产生不同部位的粘膜免疫和系统免疫,且所需的抗原量远远少于其他两组,是一个敏感、安全、可行有效的免疫途径。

关键词：免疫途径抗幽门螺杆菌 IgG抗体水平酶联免疫吸附试验皮下注射肌肉注射特异性抗体 IgA抗体鼻粘膜免疫妊娠期抗原免疫产生规律菌液浓度免疫接种分娩前后免疫应答系统免疫不同部位滴鼻免疫羊奶血清升高

His-Hsp65-6IA2P2的分离纯化及对NOD小鼠降糖作用的初步研究

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药物生物技术 2015年第4期22卷 302-306页

作者：李国梁刘坤峰卢世平洪流宗莉吴洁曹荣月金亮中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009 中国药科大学药学院江苏南京210009

构建融合蛋白His-Hsp65-6IA2P2基因工程表达菌*** BL21(DE3),诱导其表达可溶性胞外蛋白,并进行初步免疫学研究。构建p ET28a-His-Hsp65-6IA2P2质粒载体,电转化*** BL21(DE3),乳糖诱导表达及镍柱亲和层析等纯化步骤后,SDS-PAGE和Band Sca... 详细信息

构建融合蛋白His-Hsp65-6IA2P2基因工程表达菌*** BL21(DE3),诱导其表达可溶性胞外蛋白,并进行初步免疫学研究。构建p ET28a-His-Hsp65-6IA2P2质粒载体,电转化*** BL21(DE3),乳糖诱导表达及镍柱亲和层析等纯化步骤后,SDS-PAGE和Band Scan进行检测融合蛋白。最后将此融合蛋白鼻粘膜免疫NOD小鼠,观察其生理特征。融合蛋白His-Hsp65-6IA2P2正确表达,纯化后融合蛋白纯度可达95.2%。免疫动物后能够有效维持正常的体重与血糖。本实验构建了His-Hsp65-6IA2P2基因工程表达菌,成功表达了具有预防治疗及改善1型糖尿病病症潜力的融合蛋白,为进一步探究其药效奠定了基础。

关键词：融合蛋白纯化鼻粘膜免疫 NOD小鼠 1型糖尿病

粘膜佐剂CB增强Aβ抗原效应抑制痴呆鼠脑中Aβ斑块形成的研究

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粘膜佐剂CB增强Aβ抗原效应抑制痴呆鼠脑中Aβ斑块形成的研究

作者：黄田喜北京协和医学院

学位级别：硕士

研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病,是老年人中常见的一种痴呆症。AD的病理学特征主要包括脑中神经细胞外8-淀粉样多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉积导致的... 详细信息

研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病,是老年人中常见的一种痴呆症。AD的病理学特征主要包括脑中神经细胞外8-淀粉样多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉积导致的老年斑,细胞内过度磷酸化Tau蛋白导致的神经纤维缠结和神经细胞元细胞的缺失营养坏死。近年来的研究表明,采用Aβ抗原的主动免疫刺激机体产生免疫Aβ抗体,不仅抑制了脑中Aβ纤维斑块的形成,还可明显地改善实验鼠的行为和认知障碍。免疫接种疫苗清除Aβ,有可能从根本上阻止和逆转AD的病理过程,为预防和治疗AD的研究提供新的思路。但是AD主动免疫的临床Ⅱ期研究中发现有6%的研究对象出现了脑炎反应的毒副作用,目前导致这种脑炎的具体原因尚不清楚,但相关的研究提示脑炎的发生可能是T淋巴细胞介导的细胞免疫反应的结果,Q521佐剂的作用可能参与了脑炎副作用的发生过程。因此,寻找安全而且可靠的佐剂成为AD主动免疫治疗研究的一个重要方面。霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit, CB)是霍乱弧菌产生的外毒素B亚单位,能与所有有核细胞膜上的神经节苷脂(ganglioside, GM1)受体结合,具有加强抗原表位抗原性的特点[15]。CB可以作为粘膜免疫佐剂,用于强化多糖、小肽等半抗原,可以增强B淋巴细胞的反应(Th2反应),刺激机体产生高滴度的抗体,而且不刺激产生T淋巴细胞免疫反应(Th1反应)。CB在AD免疫研究中可以作为一种安全的佐剂使用于Ap疫苗免疫。除CB外,铝佐剂(AL)同样能够抑制Th1反应,是一种临床上常用的安全佐剂。因此,AL同样可以被选用于AD疫苗。选用CB、AL佐剂有可能可以降低AD免疫研究中出现的脑炎副作用。鼻粘膜在抗原的刺激下能够诱导机体产生体液免疫为主的反应,而且采用鼻粘膜免疫的方式,操作简便,便于多次加强免疫。本实验在充分考虑了佐剂安全性的基础上,选择具有良好安全性的CB、AL佐剂,配合Aβ多肽抗原,经鼻粘膜分别免疫转基因痴呆模型鼠(J20),探讨它们对Aβ多肽抗原效应的增强作用,增强的抗体效应是否能在小鼠体内发挥有效的生物学效应,包括：减少小鼠脑中Aβ的含量,抑制脑中Aβ纤维斑块的形成,改善小鼠的学习记忆能力;检测免疫后小鼠脑中Th1, Th2反应及乙酰胆碱酯酶(AChE)的含量;同时进行CB、AL二者之间的比较。实验方法繁殖转基因痴呆模型鼠,子代鼠用PCR法基因鉴定。选取转基因阳性痴呆模型鼠24只,至7月龄时随机分成4组：Aβ+CB组,Aβ+AL组,单Aβ组,阳性对照组,另设1组转基因阴性对照组,每组6只。鼻腔滴入免疫小鼠,1次／周,持续5个月,采用间接ELISA法检测小鼠的血清抗体效价。免疫结束后,Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力。水迷宫实验完成后,脱颈法处死小鼠,取小鼠左半侧脑组织制备脑匀浆上清液,双抗夹心ELISA法检测脑中Aβ的含量;取小鼠右半侧脑组织固定,免疫组织化学染色观察脑中Aβ斑块的形态。另外,ELISA试剂盒检测上述的脑匀浆上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子浓度及AchE含量。实验结果免疫5个月后,Aβ+CB组抗体效价最高(1：4000),其次为Aβ+AL组(1：2000),而未加佐剂的单Aβ组最低(1：500)。Morris水迷宫实验,与阳性对照组比较,Aβ+CB组寻找隐性平台时间缩短了50%左右(P0.05),而单Aβ组寻找隐性平台时间没有明显缩短(P>0.05)。脑中Aβ的相对含量检测结果,与阳性对照组脑中A β的相对含量(1.012±0.323)相比,Aβ+CB组脑中A β的相对含量(0.383±0.156)明显减少(P免疫组织化学观察,阳性对照组,海马区,齿状回周围以弥散的非神经突斑为主,与其他组海马区比较,AD斑块量最多;大脑皮质区,脑中Aβ斑块以弥散性的神经突斑,弥散性的非神经突斑为主,与其他组的大脑皮质区比较,Aβ斑块量最多。与阳性对照组比较,Aβ+CB组,海马区,齿状回周围同样以弥散的非神经突斑为主,Aβ斑块量减少了56.4%(P0.05);大脑皮质区所见的Aβ斑块形态与阳性对照组类似,Aβ斑块

关键词： CB佐剂 AL佐剂鼻粘膜免疫阿尔茨海默病 β-淀粉样多肽