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识别H2O2的探针分子的设计、合成及其在鼠脑原位分析中的应用

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识别H2O2的探针分子的设计、合成及其在鼠脑原位分析中的应用

作者：罗雨湖南科技大学

学位级别：硕士

过氧化氢(HO)是脑神经活动的物质基础,对维持正常的脑功能不可或缺,在脑神经生理过程和病理机制的研究中发挥着重要的指示作用。HO的浓度异常会引起氧化应激,导致蛋白质和DNA的严重损伤,且其与帕金森症和阿尔兹海默症等神经退行性疾病... 详细信息

过氧化氢(HO)是脑神经活动的物质基础,对维持正常的脑功能不可或缺,在脑神经生理过程和病理机制的研究中发挥着重要的指示作用。HO的浓度异常会引起氧化应激,导致蛋白质和DNA的严重损伤,且其与帕金森症和阿尔兹海默症等神经退行性疾病的发生息息相关。本文通过对国内外HO检测研究现状的总结,合理设计了HO识别分子并将其修饰于微电极上,构建了一种具有高灵敏度和高选择性的比率型电化学微传感器,并成功应用于鼠脑中HO水平的在体检测。基于硼酸频哪醇酯可作为HO的反应位点发生亲电反应,HO介导的芳基硼酸频哪醇酯氧化反应会生成相应的酚类,在电极上产生相应的电化学信号的基本原理。设计了七种芳基硼酸频哪醇酯分子对HO进行检测。在微电极上沉积金纳米粒子,通过Au-S键合吸附作用将芳基硼酸频哪醇酯分子修饰于微电极上。采用循环伏安法证明化合物与HO的反应产物在电极上是一个吸附过程,且发生氧化还原反应。微分脉冲伏安法测试和理论计算结果均表明o-Cl-DBP分子在电流密度、电子转移速率、表面覆盖面积、反应时间、氧化峰电位、吉布斯自由能等方面都优于其它的化合物。最终选择o-Cl-DBP分子作为检测HO的最佳分子,为进一步设计具有高灵敏度和高选择性的比率型电化学微传感器,实现生物体内HO的灵敏检测奠定了基础。选用筛选出的o-Cl-DBP分子作为HO的识别元件,通过Au-S键合作用修饰于电极上,o-Cl-DBP与HO反应生成的o-Cl-DHP的氧化峰电流密度随HO浓度的改变而变化。引入石墨烯的缺陷氧化峰充当内参比单元,以提供内置校正,同时增加电极的导电性,提高传感器的灵敏度和准确性。根据形成的o-Cl-DHP的氧化峰电流密度和石墨烯的缺陷氧化峰电流密度的比值与HO的浓度的线性关系,构建了CFME/Ox GO/Au/o-Cl-DBP比率型电化学微传感器用于准确测定HO含量。该传感器具有好的选择性、稳定性、再现性和良好的生物相容性,抗干扰能力良好,受p H的影响小,并且在HO浓度为0.5-600μM范围内有良好的线性关系。利用设计的比率型电化学微传感器对正常小鼠和PD小鼠脑内大脑皮层、纹状体和海马区三个不同区域的HO水平进行了在体检测,成功检测出正常小鼠和PD鼠大脑皮层、纹状体和海马区的HO平均浓度,发现PD鼠的HO浓度相对于正常鼠会升高。此外还通过对大鼠大脑皮层进行HO和过氧化氢酶注射,以及测量不同电极的再现性,证明该传感器在体内测量过程中具有良好的稳定性,为PD疾病的诊断提供了一种可靠的检测平台和一种新的手段。

关键词：过氧化氢在体检测硼酸频哪醇酯鼠脑比率型生物传感器

鼠脑组织中6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉及其相关生物胺的高效液相色谱-电化学检测

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色谱 2009年第2期27卷 216-219页

作者：毛健苏旸栾玉静陈薛钗邓玉林北京理工大学生命科学与技术学院北京100081

建立了大鼠脑组织中6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉（6-OH-MTHβC）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量的高效液相色谱-库仑阵列电化学检测（HPLC-ECD）方法。采用的色谱柱为Discovery（HS F5柱（250mm×4.6mm,5μm）... 详细信息

建立了大鼠脑组织中6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉（6-OH-MTHβC）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量的高效液相色谱-库仑阵列电化学检测（HPLC-ECD）方法。采用的色谱柱为Discovery（HS F5柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为缓冲液（40mmol/L柠檬酸＋20mmol/L磷酸氢二钠＋0.3mmol/L乙二胺四乙酸二钠,pH4.0）-甲醇（体积比为78∶22）混合液,流速为1mL/min。6-OH-MTHβC、5-HT、5-HIAA在1.0~500.0μg/L范围内线性关系良好（r〉0.999 2）,检出限分别为0.56,0.26,0.53μg/L,日内和日间精密度（以相对标准偏差表示）均低于6.1%,回收率分别为87.1%~98.2%,87.0%~95.3%,90.1%~97.7%。用该方法检测新生7d的SD胎鼠脑内6-OH-MTHβC及5-HT、5-HIAA的含量,发现SD胎鼠在急性酒精中毒8h后6-OH-MTHβC显著上升（P〈0.05）;而5-HT和5-HIAA的含量有所下降,但无显著性差异。该法简便、稳定、灵敏度高,适用于测定鼠脑组织中6-OH-MTHβC和5-HT,5-HIAA含量的相关研究。

关键词：高效液相色谱电化学检测 6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉 5-羟色胺 5-羟吲哚乙酸鼠脑

高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱测定鼠脑组织中神经甾体类化合物

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分析化学 2015年第8期43卷 1118-1124页

作者：刘佳张朦万有吴红海侯艳宁郑乐民尹玉新北京大学系统生物医学研究所北京大学神经科学研究所中国人民解放军白求恩国际和平医院药学部

建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定鼠脑组织中6种神经甾体类激素（别孕烯醇酮、孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质酮、四氢脱氧皮质酮、去氢表雄酮）的方法。采用Agilent XDB-C18色谱柱,以5 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相,梯度洗脱... 详细信息

建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定鼠脑组织中6种神经甾体类激素（别孕烯醇酮、孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质酮、四氢脱氧皮质酮、去氢表雄酮）的方法。采用Agilent XDB-C18色谱柱,以5 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相,梯度洗脱分离,在电喷雾正离子模式下,以多反应监测（MRM）扫描模式采集数据,基质匹配内标法定量。孕酮和脱氧皮质酮在0.10;0 ng/m L范围内呈良好的线性关系,别孕烯醇酮、孕烯醇酮、四氢脱氧皮质酮、去氢表雄酮在0.50;0 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99;在0.4,4.0和8.0 ng/m L加标水平下的平均回收率为91.2%;15.5%;相对标准偏差（RSD,n=6）为0.87%;.8%;检出限为0.04;.20 ng/m L,定量限为0.10;.50 ng/m L。

关键词：神经甾体液相串联质谱多重反应监测鼠脑

急性酒精中毒的鼠脑内乙醛及其单胺神经递质缩合物的测定

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分析化学 2010年第12期38卷 1789-1792页

作者：毛健徐妍邓玉林林凡凯谢冰洁王睿北京理工大学生命学院中国烟草总公司郑州烟草研究院

应用高效液相色谱法测定了急性酒精中毒后新生鼠脑中乙醛的含量,以及乙醛分别与多巴胺、5-羟色胺的缩合产物1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal)和6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉(6-OH-MTHβC)的含量。采用2,4-... 详细信息

应用高效液相色谱法测定了急性酒精中毒后新生鼠脑中乙醛的含量,以及乙醛分别与多巴胺、5-羟色胺的缩合产物1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal)和6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉(6-OH-MTHβC)的含量。采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)的乙腈溶液在60℃水浴中衍生15min提取脑匀浆中的乙醛,离心后进行色谱分离,检测波长为360nm,本方法简单准确,灵敏度高。应用本方法测定鼠脑组织中的乙醛含量时发现,急性酒精中毒后新生鼠脑内乙醛的含量在24h内显著高于盐水对照组(P鼠脑内Sal和6-OH-MTHβC的含量显著升高(P<0.05)。乙醛的非正常代谢及内源性神经毒素的生成可能在酒精的神经毒性机理中发挥了重要作用。

关键词：乙醛 1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉 6-羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉鼠脑

来源：博看期刊

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石蜡包埋的鼠脑样本自动收片装置设计

石蜡包埋的鼠脑样本自动收片装置设计

作者：谭璐华中科技大学

学位级别：硕士

大脑是调节机体功能的器官,也是意识、精神、学习、记忆、智能等高级神经活动的物质基础。神经元被认为是脑的基本组成单位,想要了解大脑的工作机制以及结构,首先需要获取脑内所有神经连接网络。石蜡包埋是病理检测中应用较多的包埋方法... 详细信息

大脑是调节机体功能的器官,也是意识、精神、学习、记忆、智能等高级神经活动的物质基础。神经元被认为是脑的基本组成单位,想要了解大脑的工作机制以及结构,首先需要获取脑内所有神经连接网络。石蜡包埋是病理检测中应用较多的包埋方法,具有优良的切削性能,可切成完整的连续薄切片。使用石蜡包埋鼠脑,切片后进行光学成像是获取鼠脑完整结构的有效方式。随着神经科学的不断发展,对脑组织石蜡切片收片后进行免疫组化实验被认为是研究组织中未知抗原的主要方法,但使用手工方法对整个鼠脑切片进行收集有很大难度,石蜡切片易破损的性质更是加大了切片收集的难度。针对这一难题,本文提出使用胶带粘贴样本表面进行支撑保护,再进行切片收集的自动收片方案。本文针对切片成像系统特点确定了胶带收集方案,并且通过实验验证了使用胶带收集切片的可行性;设计了用于粘贴胶带的压片滚轮,实现了边切边贴的胶带粘贴方式;通过霍尔传感器检测装置的设计实现了对胶带拉伸位置的精准控制;通过滴水压片装置的设计获取了更好的收片质量;通过对收片装置各个模块进行机械结构、硬件电路以及控制程序的设计,实现了适合于石蜡包埋的鼠脑样本切片收集的自动收片装置。最后对收片装置对于鼠脑样本的收片完整率以及切片形变量进行了测量,对收片完整率的影响因素进行实验分析改进,进一步提升了收片装置的整体性能。本文所设计的收片装置实现了石蜡包埋的鼠脑样本切片自动收集,平均收片完整率可达94.6%,收片前后样本表面不平整度在3μm以内,满足样本表面的成像要求。切片收集后切片进刀方向形变量小于7%,垂直进刀方向形变量小于5%,保证了切片较好的形态完整性。样本切片收集后进行了免疫组化,证明了收集的切片可做后续的免疫组化等实验,对感兴趣的区域进行研究。收集的切片进行更精细的成像可获取更多的样本信息,避免造成数据损失。

关键词：鼠脑石蜡包埋粘性胶带自动收片免疫组化

基于改进水平集方法的Micro-CT鼠脑三维自动化分割

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中国医疗器械杂志 2012年第3期36卷 162-167页

作者：陈诗烨王成郑秀娟上海交通大学医学院生物医学工程系上海200025 上海交通大学医学院附属仁济医院核医学科上海200127

目的提出一种基于改进水平集方法,能对Micro-CT鼠脑图像进行有效分割的自动化方法。方法首先利用模糊C均值聚类方法,并结合阈值分割和形态学方法自动设置水平集三维初始表面轮廓;其次使用梯度矢量流增强水平集在窄细等复杂结构处的演化... 详细信息

目的提出一种基于改进水平集方法,能对Micro-CT鼠脑图像进行有效分割的自动化方法。方法首先利用模糊C均值聚类方法,并结合阈值分割和形态学方法自动设置水平集三维初始表面轮廓;其次使用梯度矢量流增强水平集在窄细等复杂结构处的演化能力;最后提出一种判断演化表面轮廓附近平均带宽能量是否达到最大化来设定停止条件;最终自动化获得准确分割的结果。采用基于区域法的评价方法,计算两个对应区域的重叠比例来验证该方法的改善效果。结果利用以上方法分别对3例大鼠图像和3例小鼠图像进行测试,以重叠比例来衡量准确率分别在88.3%和87.4%,与已有的经典方法相比,平均准确度分别提高了33%和6.7%。平均处理时间分别为8min和4min。结论本方法被证明能有效应用于Micro-CT图像中鼠脑组织的分割和提取,在准确性和便捷性上都有较大改进。

关键词：鼠脑 Micro—CT 水平集模糊C均值聚类梯度矢量流三维分割

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微型电化学传感器原位分析鼠脑内小分子

微型电化学传感器原位分析鼠脑内小分子

作者：刘莉南京师范大学

学位级别：硕士

一直以来,大脑都是科学家们不懈研究的重要领域。大脑内的神经递质、神经调质和其他神经化学物质与其正常工作密切相关,影响神经系统的化学物质负责在神经元突触之间传递信息。脑化学是一个复杂的研究体系,神经化学物质（例如:一氧化氮... 详细信息

一直以来,大脑都是科学家们不懈研究的重要领域。大脑内的神经递质、神经调质和其他神经化学物质与其正常工作密切相关,影响神经系统的化学物质负责在神经元突触之间传递信息。脑化学是一个复杂的研究体系,神经化学物质（例如:一氧化氮（NO）、氧气（O2）、pH、5-羟色胺（5-HT）等）的微小变化都会对脑功能有着显著的影响。因此,分析大脑中细胞外周围的神经元内的神经化学物质的释放与摄入具有很重要的意义,这有利于更加深入地研究脑功能的分子基础。NO不仅是与许多脑疾病密切相关的自由基信使,而且是一种重要的神经元信号。研发一种灵敏可靠的生物传感器,使其能够准确地原位检测活体脑中的NO,是一个挑战。本论文设计并构建了基于hemin和Nafion修饰的碳纳米管纤维（CNF）比率型电化学传感器,可用于检测Wister大鼠脑中内源性NO以及随后脑缺血时NO水平。CNF不仅可以负载hemin分子,而且可以大大地加快电子转移速率。此外,本论文中的hemin具有双重作用:一是用作稳定的催化剂,可以实现在-0.68 V（vs.Ag/AgCl）的电位下选择性检测NO气体;二是可以作为内参比电极,提供内置校正功能,减少复杂多变的检测环境的影响,从而提高检测结果的准确性。这种比率型电化学生物传感器,NO的线性范围是25 nM～1000 nM,检出限为～10 nM,可以满足活体内测量NO的要求。该生物传感器有较好的分析性能和稳定性,以及良好的重现性,这些主要归因于微电极技术与CNT的结合。我们成功地将此生物传感器用于大鼠脑内的海马体中内源性NO的检测以及随后脑缺血过程中NO的水平,该传感器测得正常大鼠脑中的NO的平均水平为61 ± 23 nM（n=3）,但是在双侧颈动脉式脑缺血15 min后,NO的浓度增加到141±18 nM（n=3）,这为研究相关的脑疾病提供了一个可靠的方法。O2和pH值与生命体脑中的生理和病理活动密切相关,然而,人们对其中一些详细的机理却不是很清楚,这主要是由于目前缺少可用于活体内同时准确检测的分析方法。本论文设计并合成出一种有机分子—氯化血红素-氨基二茂铁（Hemin-Fc）,建立了一种单一的电化学传感器用于同时检测并比率化定量鼠脑中的O2和pH水平,以及在缺血过程中这二者随缺血时间的变化情况。Hemin的还原峰电流随着O2浓度的增加（1.3～200.6 μM）而呈现出很好的线性关系。同时,其氧化还原峰的电位随着pH的递减（8.0～5.5）也出现规律性的偏移,由此根据输出的电流信号和电位信号来同时检测O2和pH。此外,随着O2和pH的变化,Fc的电化学信号几乎保持恒定,所以Fc可以作为内参比电极,基于此,我们构建了一种比率型电化学生物传感器。这种单一生物传感器拥有很高的时间分辨率和空间分辨率,以及良好的选择性和稳定性,进一步将该电化学传感器运用于原位、实时地检测鼠脑中O2和pH随缺血时间的变化情况。此外,正常老鼠和缺血老鼠的不同脑区内O2和pH的水平在本论文中已被详细地研究。5-HT是大脑中一种重要的神经递质,属于吲哚类物质,具有电化学活性。5-HT虽然在脑中还没有十分明确的功能,但是已在多种药理学,生物学和精神病理学功能（包括抑郁症,进食障碍,酒精中毒,强迫症和焦虑）中发挥着重要作用。由于内源性5-HT的含量低且环境中有很多与5-HT的化学性质非常相似的物质,对5-HT的检测既要满足灵敏度高又要满足选择性好的要求,能够实现原位直接检测鼠脑中的5-HT的电化学测定方法屈指可数。本论文采用DPV法,选择3,3-二硫代二丙酸二（N-琥珀酰亚胺酯）（DSP）分子识别复杂环境中的5-HT,在室温条件下与之于水溶液中快速发生化学反应（5min）,使之固定在电极上。基于电极上输出的5-HT的氧化峰电流定量5-HT的浓度。碳纤维微电极（CFME）表面沉积的金纳米粒子不仅可以放大电化学信号,而且可以增加电子转移速率。此外,在微电极上共同修饰的亚甲基蓝（MB）作为内置校正电极,可以提高生物传感器在活体内的测量结果的准确性。

关键词： NO O2 pH 5-HT 微电极原位缺血中脑动脉闭塞（MCAO）再灌注鼠脑电化学生物传感器差分脉冲伏安法

两种不同缓冲系统的多聚甲醛对鼠脑组化结果的影响

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基础医学与临床 2014年第5期34卷 699-700页

作者：杜志荣张琳阴彬彭小忠中国医学科学院基础医学研究所北京100005

哺乳动物大脑皮质的发育长期以来都是发育生物学研究的焦点和热点.目前用于研究大脑发育的组织化学技术主要有原位杂交技术和免疫荧光染色,而这些技术均需要前期的标本制备,尤其是取材后的组织固定.组织固定的主要目的是尽可能保持组织... 详细信息

哺乳动物大脑皮质的发育长期以来都是发育生物学研究的焦点和热点.目前用于研究大脑发育的组织化学技术主要有原位杂交技术和免疫荧光染色,而这些技术均需要前期的标本制备,尤其是取材后的组织固定.组织固定的主要目的是尽可能保持组织内待检测物的原位性、完整性和免疫活性[1],所以组织固定的效果往往决定着组化实验最终结果的成败.4％多聚甲醛（paraformaldehyde,PFA）因其优良的理化性质成为目前固定标本组织的常用固定剂之一[2-3],而关于其配制方法,尤其是用于溶解它的溶剂的选择目前还未有定论.本研究以此问题为出发点,比较不同溶剂的4％PFA对鼠脑组织的固定效果,探讨最佳的组织固定方法.

关键词：多聚甲醛组化鼠脑组织化学技术系统缓冲免疫荧光染色原位杂交技术

狂犬病病毒强弱毒株感染鼠脑的mRNA差异表达基因的初步筛选

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中国兽医学报 2012年第5期32卷 692-695页

作者：齐艳君康震宋菲菲张守峰扈荣良张乐萃青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122

为阐明狂犬病病毒(RV)不同毒力株感染鼠脑后基因表达的差异,进一步揭示RV感染和机体抗感染应答的分子机制。本试验应用差异显示技术分析了正常鼠脑悬液、狂犬病病毒SRV9弱毒株及BD06街毒株感染鼠脑48h的基因水平变化。结果显示,与对照... 详细信息

为阐明狂犬病病毒(RV)不同毒力株感染鼠脑后基因表达的差异,进一步揭示RV感染和机体抗感染应答的分子机制。本试验应用差异显示技术分析了正常鼠脑悬液、狂犬病病毒SRV9弱毒株及BD06街毒株感染鼠脑48h的基因水平变化。结果显示,与对照组相比,SRV9与BD06组有4对共同上调表达差异片段;与其它两组比较,SRV9组有2个基因上调表达,BD06组存在1个上调表达基因。这些差异基因体现了宿主细胞对RV感染的应答模式以及不同毒株感染间的差异,为深入研究RV致病机理奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒鼠脑差异显示