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羟丁基壳聚糖的制备及其与鼠胚胎成纤维细胞的生物相容性研究

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组织工程与重建外科杂志 2011年第2期7卷 85-88页

作者：孙伟季翔汪谟贞方月娥赵宇汪春兰安徽医科大学第一附属医院整形外科安徽省合肥市230022 中国科学技术大学安徽省合肥市230026

目的制备温敏型壳聚糖衍生物羟丁基壳聚糖(Hydroxybutyl chitosan,HBC),研究鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblasts,MEF)与HBC的相容性,探讨羟丁基壳聚糖作为组织工程材料的可行性。方法对壳聚糖化学改性制备HBC,研究其最佳制备... 详细信息

目的制备温敏型壳聚糖衍生物羟丁基壳聚糖(Hydroxybutyl chitosan,HBC),研究鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblasts,MEF)与HBC的相容性,探讨羟丁基壳聚糖作为组织工程材料的可行性。方法对壳聚糖化学改性制备HBC,研究其最佳制备条件。使用不同溶剂对HBC进行溶解实验;利用红外光谱、扫描电镜对产物结构进行观察。从小鼠胚胎中分离培养MEF;MTT法测定HBC对MEF活性的影响。结果制备的4种HBC均能溶于水,55℃反应14 h的HBC 4水溶性较好。HBC溶液在37℃具有明显的溶胶-凝胶的转变,通过物理交联形成凝胶并可逆。不同反应条件下制得的4种HBC浸提液对MEF细胞的毒性均在0级或1级,表现出良好的生物相容性。结论成功制备羟HBC,HBC具有良好的温度敏感性及体温(37℃)下凝胶的特性,与MEF生物相容性良好,是一种具有应用前景的新型组织工程材料。

关键词：羟丁基壳聚糖鼠胚胎成纤维细胞温敏凝胶组织工程

miR-505-3p在小鼠胚胎成纤维细胞中抑制可变剪接因子以调控运动神经元存活基因可变剪接

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中国组织化学与细胞化学杂志 2016年第6期25卷 487-493页

作者：杨侃李晓宁马骁骁李凯周宇荀肖君华东华大学环境科学与工程学院东华大学化学化工与生物工程学院上海201620

目的探究微小RNA 505-3p(miR-505-3p)对于运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)可变剪接的影响。方法利用生物信息学数据库预测miR-505-3p靶基因,构建双荧光素酶报告载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibrobla... 详细信息

目的探究微小RNA 505-3p(miR-505-3p)对于运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)可变剪接的影响。方法利用生物信息学数据库预测miR-505-3p靶基因,构建双荧光素酶报告载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中验证靶基因为可变剪接因子(alternative splicing factor,ASF)基因,运用免疫印迹和免疫荧光染色验证miR-505-3p对ASF的抑制效果,利用实时定量PCR技术检测miR-505-3p对具有正常功能的全长SMN(SMN-FL)以及含有毒性的第7号外显子缺失的SMN(SMN-D7)表达量的影响及ASF在其中的作用。结果 miR-505-3P直接结合ASF3'端调控区并抑制ASF mRNA及蛋白表达量,抑制ASF蛋白在细胞核中的表达和分布。过表达miR-505-3p促进SMN-FL向SMND7的转化,而过表达靶基因ASF或者抑制miR-505-3p促进SMN-FL的保留。结论 ASF对SMN基因正常剪接形成SMNFL是必需的,miR-505-3p通过抑制ASF,从而干扰ASF对于SMN可变剪接的调控,导致正常的SMN-FL向毒性的SMN-D7转化。

关键词： miR-505-3p 可变剪接因子运动神经元存活基因鼠胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与干细胞饲养层的制备

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小鼠胚胎成纤维细胞的分离与干细胞饲养层的制备

作者：胡海北南方医科大学

学位级别：硕士

背景胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)来源于囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)细胞和原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs);诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPS cells)]是由成体细胞逆转而成的具有与ES细胞类似全能性的细胞,二者均有无限增殖、自我更新和多向分化潜能,能够向不同的组织细胞分化。ES细胞及iPS细胞体外培养极易自发分化,必须在培养基中加入分化抑制因子或者将其培养在饲养层细胞上。单独的细胞因子抑制其分化效果不理想,目前多数实验研究采用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)来制备饲养层。虽然已有无饲养层培养体系的报道或应用人胎盘成纤维细胞建立人类ES细胞系,但小鼠胚胎成纤维细胞作为ES细胞培养最常用的方法,取材方便,成本低廉,且能分泌细胞因子有效的抑制ES细胞及iPS细胞自发分化和促进其增殖,MEF作为饲养层能有效地促进ES细胞及iPS细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为ES细胞及iPS细胞提供类似的胚胎发育环境,因此在研究ES细胞及iPS细胞时得到广泛的应用。本实验以ICR品系小鼠为实验材料,对MEF的分离培养和饲养层的制备的最佳条件进行探索,并验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果,为后期进一步研究ES细胞及iPS细胞提供实验基础。目的建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体外培养体系,优化小鼠胚胎成纤维细胞的分离方法及饲养层的制备方法,探索稳定的ICR小鼠胚胎成纤维细胞分离的条件,以及胚胎干细胞饲养层细胞制备的最佳方法,建立符合自身实验条件的干细胞体外饲养层培养体系,对课题组今后的实验提供实践基础,为同类实验对实验条件进行规范化提供依据。方法1.使用胰蛋白酶消化法体外分离MEF,利用不同浓度胰蛋白酶消化ICR小鼠胚胎组织不同时间,在显微镜下观察不同实验组细胞形态,贴壁快慢,记录获取原代细胞数量、苔酚蓝染色检测分离原代细胞培养12h后的存活率等,优化胰蛋白酶消化法体外分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞的最佳实验条件。2.对第2至第7代MEF的生长状态,增殖活力进行比较,观察其光学显微镜下细胞形态,细胞计数观察其增殖速度,并使用统计图描述各组细胞生长曲线,探索第几代细胞最适合制备饲养层。为饲养层细胞的制备提供理论依据。3.选择第3代MEF,利用5%、10%、15%、20%不同血清浓度培养基进行培养,每天每个实验组取5个样本进行细胞计数以检测细胞增殖速度,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差齐性检验,若方差齐,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)险验各实验组是否存在显著差异,如果存在显著差异,则进一步使用LSD法做组间两两比较;若方差不齐,用Welch检验法检验组间是否存在显著性差异,若组间存在显著性差异,则进一步使用Dunnttt T3法检验组间的差异。探索MEF体外培养的最佳血清浓度。4.选择第3代细胞制备饲养层,利用不同浓度的丝裂霉素C (5ug/ml, 10ug/ml,1 5ug/ml,20ug/ml)处理MEF不同时间(1h、2.5h、3.5h)后,使用MTT法检测其培养的3、6、8天细胞活力,酶联仪上检测各实验组MEF在570nm处的吸光度OD值,将相同实验条件下(丝裂霉素C浓度及处理时间)的样本以培养时间分组,利用Levene方法做方差齐性检验,若方差齐,则用One-Way ANOVA检验组间是否存在显著差异;若方差不齐,则用Welch法检验组间是否存在显著差异。确定制备饲养层细胞的最佳方法。并利用荧光法检测制备的饲养层细胞有无支原体感染。5.利用MEF制备饲养层培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞,观察干细胞在饲养层上的生长状态,根据倒置纤维镜下观察分化细胞在克隆中所占的比例,将hES细胞及iPS细胞克隆分为未分化(分化细胞占克隆细胞比例≤20%)和分化(分化细胞占克隆细胞比例≥20%)两类,实验取3复孔计算hES细胞及iPS细胞分化与未分化克隆数,分析饲养层细胞支持hES细胞及iPS细胞生长状况及观察细胞分化情况,同时利用RT-PCR检测其干细胞标志基因Nanog、OCT-4的表达,验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果。7.统计方法：运用SPSS13.O统计软件进行统计分析,所有数据均以均数或者均数士标准差(X±S)表示。不同代次细胞的生长情况使用统计图描述;不同血清浓度对MEF增殖的影响用,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差

关键词：鼠胚胎成纤维细胞丝裂霉素C 饲养层干细胞

HCMV基因在人和小鼠胚胎成纤维细胞中表达的差异性研究

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微生物学杂志 2013年第5期33卷 25-31页

作者：杨瑞王斌钱冬萌李玲周雯王桐梅胡明陈豪宋旭霞青岛大学医学院病原生物学教研室山东青岛266071

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)种属特异性机制尚不清楚。研究通过检测HCMV AD169体外感染人胚胎成纤维细胞(Human embryo fibroblast,HEF)和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)后病毒基因的表达情况,探讨HCMV种属特异性的可能分子机制。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染HEF和MEF,相差显微镜逐日观察细胞的形态学变化;RT-PCR检测HCMV即刻早期(IE1、IE2)、早期(UL84)和晚期基因(UL83)的表达情况;Western-blot和免疫荧光检测病毒基因编码蛋白表达的情况。形态学观察发现HEF感染HCMV后逐渐变大变圆并相互融合,第4天可见典型的HCMV特征性病变效应,而MEF则未出现上述的变化;RT-PCR和Western-blot表明HEF组表达即刻早期基因IE1和IE2、早期基因UL84和晚期基因UL83 mRNA以及各基因所编码的蛋白,且相对表达量显著高于模拟感染组(P﹤0.01);而MEF组仅IE1和IE2 mRNA和蛋白相对表达量显著低于HEF组(P﹤0.05),而高于模拟感染组(P﹤0.01)。免疫荧光检测发现HEF感染72 h表达IE和UL83蛋白,而MEF则无明显表达。以上结果表明,HCMV不能在MEF中复制并产生完整子代病毒颗粒,且病毒基因表达阻止在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前,其种属特异性可能与即刻早期蛋白低水平的表达量有关。

关键词：人巨细胞病毒人胚胎成纤维细胞鼠胚胎成纤维细胞即刻早期基因

鼠角膜缘干细胞3D共培养模型的建立及生存率、表型维持

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华中科技大学学报（医学版） 2012年第6期41卷 680-683,703页

作者：熊林杰郑恬胡义珍华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科武汉430022

目的探讨纤维蛋白凝胶、鼠胚胎成纤维细胞与鼠角膜缘干细胞的3D共培养模型是否有助于角膜缘干细胞的生存率提高和细胞表型的维持。方法细胞采用96孔圆底培养板培养,并分为3组:①鼠角膜缘干细胞单独培养组(A组),含3×104个角膜缘干细胞;... 详细信息

目的探讨纤维蛋白凝胶、鼠胚胎成纤维细胞与鼠角膜缘干细胞的3D共培养模型是否有助于角膜缘干细胞的生存率提高和细胞表型的维持。方法细胞采用96孔圆底培养板培养,并分为3组:①鼠角膜缘干细胞单独培养组(A组),含3×104个角膜缘干细胞;(2)鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白共培养组(B组),将纤维蛋白原配成10mg/mL的磷酸盐溶液,与鼠角膜缘干细胞混合成3×105/mL的混合悬液,取100μL细胞悬液培养;③鼠角膜缘干细胞、纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞共培养组(C组),将鼠角膜缘干细胞与鼠胚胎成纤维细胞以1∶0.5混合,配成含有10mg/mL纤维蛋白原的4.5×105/mL混合悬液,取100μL进行培养。于培养后4、24和48h,以AnnexinⅤ染色,采用流式细胞仪检测其细胞生存率和凋亡率。以Western blot检测角膜缘干细胞分化蛋白Keratin K3/K76的表达。结果角膜缘干细胞在4、24和48h的生存率最高者为C组,分别是(95.7±2.0)%、(95.1±1.2)%和(92.0±1.7)%;其次为B组,分别是(95.2±3.0)%、(89.8±1.5)%和(80.0±0.8)%;最低为A组,分别是(95.0±1.2)%,(84.5±1.2)%和(70.0±0.9)%。细胞凋亡率的趋势与此相反。角膜干细胞分化蛋白的表达强度,在4h时各组之间的表达强度无统计学差异,但在48h时,C组的表达强度(70±4)明显低于B组(97±6)和A组(102±4)。结论鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞的共同培养模式有助于提高角膜缘干细胞在3D培养中的存活率,可减少鼠角膜缘干细胞的分化和有益于其表型的维持。

关键词：鼠角膜缘干细胞鼠胚胎成纤维细胞纤维蛋白 3D共培养细胞存活细胞分化表型

化学小分子联合生长因子诱导成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元和施旺细胞的研究

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化学小分子联合生长因子诱导成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元和...

作者：王永辉上海交通大学

学位级别：硕士

外源过表达特异性转录因子,促进哺乳动物的体细胞转分化为多巴胺能神经元(Dopaminergic neuron,DA),这是一种有希望治疗帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)的方法。但这种方法存在一些缺点,例如可能引起病毒载体整合到宿主细胞的基因组... 详细信息

外源过表达特异性转录因子,促进哺乳动物的体细胞转分化为多巴胺能神经元(Dopaminergic neuron,DA),这是一种有希望治疗帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)的方法。但这种方法存在一些缺点,例如可能引起病毒载体整合到宿主细胞的基因组中,这种潜在的危险限制了其临床应用,因此,目前能找到一个更可靠的产生多巴胺能神经元的方法非常关键。目前,我们的实验结果证明鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblsts,MEFs)在化学小分子联合生长因子的诱导下可以转分化成多巴胺能神经元。我们的实验不仅证明了这些神经元样细胞具有神经元的形态和免疫化学特征,而且证明了这些神经样细胞可表达神经元的标志蛋白,进一步的钙成像试验也证明这种神经元样细胞具有同神经元相似的钙电流的电生理特性。更重要的是,这些转分化而来的细胞可以分泌多巴胺,表明这些细胞在功能上与多巴胺能神经元非常相近。综上所述,我们的研究证明,,在不引入转录因子的情况下,通过化学小分子联合生长因子诱导产生多巴胺能神经元的方法,可能对帕金森病的治疗带来新的希望。脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是由于外伤、炎症、肿瘤等原因引起脊髓横贯性损害而出现损伤平面以下的运动、感觉、括约肌及自主神经等功能障碍。在脊髓损伤的治疗中,施旺细胞(Schwann cells,SC)已经被证明通过分泌神经营养因子促进损伤的神经元再生。目前可以通过胚胎干细胞或诱导型多能干细胞分化为施旺细胞,也可以诱导鼠胚胎成纤维细胞先去分化为神经嵴细胞再分化为施旺细胞。在这里,我们证明鼠胚胎成纤维细胞在化学小分子和生长因子的诱导下可以转分化为施旺细胞。通过施旺细胞标志物PLP和S100β免疫荧光染色和Q-PCR实验证明转分化的细胞具有施旺细胞的免疫化学特性和基因表达特性。综上所述,我们的研究证明了通过化学小分子和生长因子可以将鼠胚胎成纤维细胞转分化为施旺细胞,并且这种方法可能对脊髓损伤的治疗带来新的希望。

关键词：小分子转分化成纤维细胞多巴胺能神经元鼠胚胎成纤维细胞化学小分子生长因子施旺细胞

一种生物可吸收性形状记忆聚合物的生物相容性研究

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中华损伤与修复杂志（电子版） 2013年第4期8卷 18-21页

作者：程晓松卢慧敏周潘宇夏琰黄蓉蓉许硕贵第二军医大学附属长海医院骨科上海200433 第二军医大学附属长海医院麻醉科上海200433 解放军第一八〇医院烧伤科泉州362000

目的初步探讨生物可吸收性形状记忆聚合物(biodegradable shape-memory polymer,BSMP)的生物相容性。方法体外试验:将鼠胚胎成纤维细胞与BSMP共培养,观察细胞形态特征,并通过MTT检测评价BSMP的体外生物相容性。体内实验:将BSMP植入新西... 详细信息

目的初步探讨生物可吸收性形状记忆聚合物(biodegradable shape-memory polymer,BSMP)的生物相容性。方法体外试验:将鼠胚胎成纤维细胞与BSMP共培养,观察细胞形态特征,并通过MTT检测评价BSMP的体外生物相容性。体内实验:将BSMP植入新西兰兔皮下与肌肉内,术后不同时间点观察局部与宏观表现后取材送组织学检查,并检测材料埋入肌肉后的重量丢失百分比,综合评价BSMP的体内生物相容性。结果与BSMP共培养的BSMP组鼠胚胎成纤维细胞与未与BSMP共培养的对照组相比,生长状态良好,MTT检测无明显差异(P>0.05);皮内植入BSMP24、48、72h后BSMP组及对照组手术部位均未发现红斑或水肿,皮内刺激检测的评分是0,且BSMP植入皮内后的第2周及第4周BSMP组及对照组的组织学观察没有发现明显的栓塞、水肿、坏死及炎性介质反应;BSMP植入肌肉后24周的降解总量达8.4%。结论 BSMP生物相容性良好,体内降解速率稳定,是一种良好的聚合材料。

关键词：生物可吸收形状记忆聚合物生物相容性鼠胚胎成纤维细胞

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新型萘醌类衍生物对细胞衰老的抑制作用

黑龙江八一农垦大学学报 2015年第4期27卷 72-76页

作者：王昊乾孔令祖申贵男韩英浩黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院大庆163319

通过对萘醌类化合物的化学修饰,研究2-取代5,8-二甲氧基-1,4-萘醌类衍生物对鼠胚胎成纤维细胞(MEF)衰老的抑制作用。应用噻唑蓝(MTT)、流式细胞术(FCM)、SA-β-gal染色等方法检测多种萘醌衍生物对细胞毒性、细胞内活性氧(ROS)水平和细... 详细信息

通过对萘醌类化合物的化学修饰,研究2-取代5,8-二甲氧基-1,4-萘醌类衍生物对鼠胚胎成纤维细胞(MEF)衰老的抑制作用。应用噻唑蓝(MTT)、流式细胞术(FCM)、SA-β-gal染色等方法检测多种萘醌衍生物对细胞毒性、细胞内活性氧(ROS)水平和细胞衰老的作用,实验结果显示:2-苄硫基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌在降低其细胞毒性作用的同时,具有清除细胞内活性氧从而抑制细胞衰老的作用。

关键词：萘醌类衍生物活性氧细胞衰老鼠胚胎成纤维细胞

人胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞饲养层细胞的制备方法

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国际口腔医学杂志 2014年第3期41卷 268-271页

作者：谭小兵 George T-J Huang 云南省第一人民医院口腔内科昆明650032 美国波士顿大学牙学院牙体牙髓病学系波士顿ma02118

目的建立一种能维持人胚胎干细胞（ESC）和诱导性多功能干细胞（iPSC）生长的饲养层细胞的标准制备方法。方法选取受孕12．5-14．5d的CF-1雌鼠，原代培养的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）经丝裂霉素C处理后作为饲养层细胞，观察其维持人ESC和i... 详细信息

目的建立一种能维持人胚胎干细胞（ESC）和诱导性多功能干细胞（iPSC）生长的饲养层细胞的标准制备方法。方法选取受孕12．5-14．5d的CF-1雌鼠，原代培养的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）经丝裂霉素C处理后作为饲养层细胞，观察其维持人ESC和iPSC的生长情况；同时研究不同培养器具所需细胞数量，制备高质量饲养层细胞。结果经丝裂霉素C处理后，MEF可很好维持人ESC和iPSC的生长，使其保持自我更新能力和未分化状态；控制铺板的细胞密度，可得到高质量饲养层细胞。结论本实验得到的饲养层细胞能很好支持人ESC和iPSC生长，可作为饲养层细胞制备的标准方法使用。

关键词：人胚胎干细胞人诱导性多功能干细胞饲养层细胞鼠胚胎成纤维细胞