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Wnt3a在多能干细胞向黑素细胞分化过程中的定量分析

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Wnt3a在多能干细胞向黑素细胞分化过程中的定量分析

作者：曲勃维江苏大学

学位级别：硕士

黑素细胞能够分泌黑色素,是保护皮肤抵御紫外线辐射损伤与形成肤色的重要基础。功能性黑素细胞的缺乏与破坏会导致色素脱失性疾病,最常见的疾病有白癜风,白癜风的治疗效果不尽人意,而黑素细胞移植是一种有效的疗法。由于成熟黑素细胞难... 详细信息

黑素细胞能够分泌黑色素,是保护皮肤抵御紫外线辐射损伤与形成肤色的重要基础。功能性黑素细胞的缺乏与破坏会导致色素脱失性疾病,最常见的疾病有白癜风,白癜风的治疗效果不尽人意,而黑素细胞移植是一种有效的疗法。由于成熟黑素细胞难以在体外进行大量培养和扩增,而多能干细胞(PSC)是具有多能性和自我更新特性的细胞,能够被诱导分化为黑素细胞,可为移植提供细胞来源。Wnt3a蛋白在黑素细胞发生发育中起到重要的作用,在PSC向黑素细胞诱导分化的过程中不可替代。目前PSC诱导分化黑素细胞的培养体系可添加L Wnt-3a条件培养基(L Wnt-3a CM)作为Wnt3a蛋白的来源,但现有L Wnt-3a CM的收集方法尚未明确Wnt3a蛋白浓度。本研究首先绘制L Wnt-3a细胞的生长曲线,对不同时段收集到的培养上清液利用ELISA法定量检测其Wnt3a蛋白的浓度,建立收集培养上清制作L Wnt-3a CM的方案,并将收集到的L Wnt-3a CM应用于PSC三维诱导分化黑素细胞的培养体系,通过形态学观察,基因表达检测,功能学验证等实验,对比了不同浓度的L Wnt-3a CM以及重组Wnt3a蛋白对分化效率的影响。结果发现:(1)在L Wnt-3a细胞生长到达平台期后的6天内的Wnt3a蛋白分泌量高于其他时段,且以6.25’10个/cm 、1.25’10个/cm 、2.5’10个/cm 的密度接种细胞,在培养的平台期后6天内收集的上清液中的Wnt3a蛋白量无统计学差异,而2.5’10个/cm 接种组进入平台期的时间为2天,可节约时间成本。(2)多能干细胞WA09及WTC-11细胞株能够在明确Wnt3a浓度的黑素细胞悬浮诱导分化系统中稳定分化,获得的细胞具有与人表皮黑素细胞高度类似的形态和特性。(3)使用明确Wnt3a浓度的上清液作为Wnt3a蛋白来源的PSC三维黑素细胞诱导体系与使用重组Wnt3a蛋白的效率相似。(4)本研究采用的条件培养基收集方案比直接购买重组Wnt3a蛋白更经济。本研究优化的Wnt3a蛋白上清收集方案能够提供稳定充足并且经济的Wnt3a蛋白来源,能够成功应用于PSC黑素细胞分化,为研究PSC的分化机制提供了研究模型,同时也为今后针对条件培养基与重组蛋白在分化中的具体效价提供参考。

关键词：多能干细胞诱导多能干细胞黑素细胞分化拟胚体 Wnt3a

外周血间充质干细胞调节白癜风小鼠黑素细胞氧化应激的体外研究

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外周血间充质干细胞调节白癜风小鼠黑素细胞氧化应激的体外研究

作者：张萌遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:研究外周血间充质干细胞(Peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PBMSCs)对B16黑素瘤细胞氧化应激损伤的体外抑制调节作用;初步探索PBMSCs通过IL-10/PI3K/Akt信号通路发挥抗氧化、抗凋亡,逆转B16黑素瘤细胞氧化应激状... 详细信息

目的:研究外周血间充质干细胞(Peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PBMSCs)对B16黑素瘤细胞氧化应激损伤的体外抑制调节作用;初步探索PBMSCs通过IL-10/PI3K/Akt信号通路发挥抗氧化、抗凋亡,逆转B16黑素瘤细胞氧化应激状态的作用机制。方法:1.大鼠PBMSCs分离、培养及鉴定:体重150-200 g的SD大鼠经皮下注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员5 d后,5%戊巴比妥钠(0.1 m L/100 g)麻醉大鼠,无菌条件下自大鼠左心室采集外周血5 m L,经密度梯度离心法获得单个核细胞,接种于含10%FBS、0.01μg/m L b FGF、2 mmol/L谷氨酰胺的α-MEM培养基,置37°C、5%CO的饱和湿度培养箱培养;流式细胞术对富集的P3代PBMSCs进行CD29、CD44、CD90、CD11b、CD45和CD79表面标志物的表型鉴定分析。2.小鼠B16黑素瘤细胞的培养:B16黑素瘤细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基,置37°C、5%CO的饱和湿度培养箱培养,待细胞生长汇合度达85%-95%时进行传代培养。3.小鼠白癜风体外细胞模型的建立:采用HO诱导B16黑素瘤细胞氧化应激损伤这一策略制备白癜风体外细胞模型;实验分别用0、0.5、1、1.5、2 mmol/L HO处理B16黑素瘤细胞6、12、24和48 h,CCK8检测B16黑素瘤细胞的增殖活力,流式细胞术检测B16黑素瘤细胞的ROS含量以及细胞凋亡率,籍以选择最佳的HO刺激浓度和时间,建立可靠的小鼠白癜风体外细胞模型。4.PBMSCs旁分泌IL-10的ELISA检测:利用Transwell 6孔培养板将PBMSCs(0.4μm孔径的上室)与HO诱导的B16黑素瘤细胞氧化应激细胞模型进行间接共培养作为实验组(HO-B16+PBMSCs组),并设置PBMSCs单独培养作为对照(PBMSCs组)。分别于共培养6、12、24、48 h收集两组培养上清,利用特异性针对大鼠IL-10的ELISA试剂盒检测两组大鼠PBMSCs旁分泌IL-10的表达量。5.PBMSCs逆转B16黑素瘤细胞氧化应激作用及其与IL-10/PI3K/Akt通路激活的关系研究:采用Transwell 6孔培养板进行PBMSCs(接种于上室)与HO诱导后的B16黑素瘤细胞氧化应激模型细胞进行间接共培养,实验分组如下:B16黑素瘤细胞单独培养作为对照组(B16组),HO诱导B16黑素瘤细胞氧化应激作为模型组(HO-B16组),HO诱导B16黑素瘤细胞氧化应激后添加IL-10干预培养组(HO-B16+IL-10组),HO诱导B16黑素瘤细胞氧化应激后与PBMSCs共培养组(HO-B16+PBMSCs组);实验还将HO-B16+PBMSCs组再下设为AB9969(IL-10中和抗体)组和LY294002(PI3K抑制剂)组。各组共培养24 h后,CCK8检测B16黑素瘤细胞的增殖活力,流式细胞术检测B16黑素瘤细胞的ROS含量和细胞凋亡率,Western Blot(WB)检测B16黑素瘤细胞PI3K/Akt通路分子Akt、p-Akt以及抗氧化和凋亡关键因子HO-1、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白的表达情况。结果:1.大鼠PBMSCs分离、培养及鉴定:富集的PBMSCs形态为相对均一的梭形细胞,呈放射样漩涡状生长;流式细胞术鉴定培养的PBMSCs高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD11b、CD45、CD79。2.小鼠B16黑素瘤细胞培养:B16黑素瘤细胞呈梭形和成纤维细胞样贴壁生长,低密度时,细胞较细长,随着密度的增加,细胞呈树突状突起并交织成网状结构。3.小鼠白癜风氧化应激细胞模型的建立:CCK8结果显示,1 mmol/L的HO刺激B16黑素瘤细胞6、12、24和48 h后,各时间点的细胞活力均明显低于空白对照组(0mmol/L)(P?0.05),且流式细胞术检测1 mmol/L的HO刺激各时间点的B16黑素瘤细胞ROS的表达含量和凋亡率水平均显著高于空白对照组(P?0.05),据此,后续实验选用1 mmol/L HO刺激B16黑素瘤细胞6 h(细胞活力较高,ROS表达含量和凋亡率水平相对较低)作为最佳的氧化应激细胞模型制模刺激条件。4.PBMSCs旁分泌IL-10水平的ELISA检测结果:PBMSCs组与HO-B16+PBMSCs组大鼠PBMSCs的IL-10旁分泌水平均随着时间的推移逐渐增多,6 h和12 h时2组的IL-10的表达量无显著差异(P?0.05),而24 h和48 h时的IL-10的表达量后者明显高于前者(P黑素瘤细胞氧化应激的机制研究结果:(1)细胞活力的CCK8检测结

关键词：外周血间充质干细胞白癜风黑素细胞氧化应激细胞凋亡

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白癜风代谢重塑:进展和未来

中华皮肤科杂志 2024年第1期57卷 8-11页

作者：李春英陈健儒李舒丽空军军医大学西京皮肤医院西安710032

本文结合最新的白癜风基础研究成果,探讨了糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和肠道菌群代谢重塑对于白癜风发病机制的意义,尝试描绘白癜风代谢重塑的全景图,并讨论在未来的基础研究中辩证统一地把握多种代谢途径的相互串扰和从整体角度思... 详细信息

本文结合最新的白癜风基础研究成果,探讨了糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和肠道菌群代谢重塑对于白癜风发病机制的意义,尝试描绘白癜风代谢重塑的全景图,并讨论在未来的基础研究中辩证统一地把握多种代谢途径的相互串扰和从整体角度思考多种代谢途径重塑在个体白癜风发病中作用机制的重要性,以期促进对白癜风发病的认识和发掘潜在的治疗手段.

关键词：白癜风黑素细胞代谢重塑糖代谢脂质代谢氨基酸代谢肠道菌群代谢

昼夜节律基因对人表皮黑素细胞生理活动调控的初步探究

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昼夜节律基因对人表皮黑素细胞生理活动调控的初步探究

作者：陈雁雁江苏大学

学位级别：硕士

目的:精准的时序调控对于机体健康至关重要。起源于神经嵴的人表皮黑素细胞除了具有经典的黑色素合成特性,还具备神经内分泌、光敏感等功能,是人体重要的功能细胞。然而目前尚不明确昼夜节律是否参与调节黑素细胞各种生理活动。本研究... 详细信息

目的:精准的时序调控对于机体健康至关重要。起源于神经嵴的人表皮黑素细胞除了具有经典的黑色素合成特性,还具备神经内分泌、光敏感等功能,是人体重要的功能细胞。然而目前尚不明确昼夜节律是否参与调节黑素细胞各种生理活动。本研究旨在探讨正常人表皮黑素细胞生理特征并进一步探究核心昼夜节律基因对其生理活动的调控作用。方法:首先利用从正常人皮肤组织中分离培养的表皮黑素细胞,通过形态学观察和多巴染色的方法对其进行鉴定。使用RT-qPCR法验证了黑素细胞内光敏视蛋白基因(OPN1-OPN5)和神经内分泌合成关键酶(PC1,PC2,AANAT,TPH1)等功能基因的表达。使用地塞米松同步处理建立体外节律振荡模型,检测时钟基因的节律表达;并分析了包括黑素合成、细胞增殖、DNA损伤修复、神经内分泌功能的关键基因在24小时内的表达规律。摸索确定最佳的siRNA干扰条件后,利用干扰核心时钟基因CRY1和PER2来构建时钟基因扰乱模型,进一步分析昼夜节律扰乱后受生物钟调控下游基因的表达差异性,从而探索昼夜节律机制对黑素细胞各种生理过程的调控关系。结果:1.正常人包皮组织所分离的黑素细胞表达光敏视蛋白家族基因(OPN1,OPN2,OPN3,OPN4,OPN5);表达褪黑素合成限速酶(AANAT,TPH)、POMC合成过程关键酶(PC1,PC2)以及表达雌激素受体ER和雄激素受体AR基因,为皮肤神经内分泌网络重要组成部分。2.利用100nM地塞米松孵育处理,成功构建了正常人表皮黑素细胞体外节律振荡模型,核心时钟基因(PER2,PER3,CRY1,CLOCK,BMAL1,REV ERBα)的表达均表现为24小时为周期的波动。在体外同步模型中验证了黑色素合成关键基因MITF,DNA损伤修复关键基因XPA,细胞增殖相关基因cMyc以及黑素细胞褪黑素合成关键酶AANAT和糖皮质激素合成关键酶PC1基因表达均为节律波动(P黑素细胞的siRNA的干扰体系,并使用siRNA技术沉默时钟基因CRY1成功构建了体外节律扰乱模型,并在干扰时钟基因CRY1后48小时发现MITF,TYR,PC1基因上调,cMyc基因下降,表明生物钟基因CRY1与黑色素合成、糖皮质激素合成以及细胞增殖存在相关性。进行连续分点监测提示,干扰组MITF,cMyc基因表达失去节律性。结论:黑素细胞内具有以24小时为周期的内源性昼夜节律调节机制。昼夜节律对人表皮黑素细胞黑素合成、DNA损伤修复、神经内分泌合成活动具有一定调节作用。对黑素细胞时间生理学的深入研究将为理解黑色素相关疾病的发生以及开发新的治疗靶点提供新的思路。

关键词：昼夜节律黑素细胞 PER2 CRY1 神经内分泌 siRNA转染

转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式

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中华皮肤科杂志 2024年第1期57卷 29-33页

作者：马晶晶亢盼郭森坚哲李春英李舒丽空军军医大学西京皮肤医院西安710032

目的探究转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式.方法收集空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期白癜风患者皮损组织,同时收集性别、年龄匹配的5例来源于整形外科手术剩余皮肤组... 详细信息

目的探究转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式.方法收集空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期白癜风患者皮损组织,同时收集性别、年龄匹配的5例来源于整形外科手术剩余皮肤组织作为健康对照.培养永生化的健康人表皮黑色素细胞系PIG1、白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V及人表皮原代黑色素细胞,其中原代黑色素细胞分离自西京医院泌尿外科手术切除的3例健康男性包皮组织.采用组织免疫荧光检测TFAP2B、多巴色素互变异构酶(DCT)在健康对照皮肤和白癜风皮损中的表达及定位,细胞免疫荧光和Western印迹法检测TFAP2B在人表皮黑色素细胞中的表达.两组间比较采用t检验,相关性分析采用Pearson相关分析法.结果组织免疫荧光结果显示,TFAP2B仅在人表皮黑色素细胞中表达,且定位于细胞核.Western印迹结果显示,TFAP2B在人表皮黑色素细胞系PIG1及原代黑色素细胞中强表达(相对表达量分别为0.45±0.05和0.36±0.04).组织免疫荧光结果显示,在10例人表皮组织(包括5例健康对照和5例白癜风)中,TFAP2B(623917.5±88784.0)与DCT(2232655.3±588810.4)的荧光强度呈显著正相关(r=0.91,P细胞中相对荧光强度(0.12±0.05)显著低于健康对照表皮黑色素细胞(1,t=19.35,P细胞系PIG3V中的相对表达值(0.62±0.09)亦显著低于PIG1细胞(1,t=5.92,P细胞中特异性高表达,其表达与黑色素细胞标记分子DCT的表达呈显著正相关,在白癜风患者表皮黑色素细胞中明显低表达.

关键词：白癜风黑素细胞表皮转录因子AP-2 多巴色素互变异构酶表达模式

黑素细胞及相关细胞群参与白癜风发病的研究进展

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中华皮肤科杂志 2020年第9期53卷 751-754页

作者：许爱娥周妙妮林福全杭州市第三人民医院皮肤科 310009

白癜风发病机制复杂,黑素细胞缺失是核心。目前认为除黑素细胞自身缺陷外,表皮和真皮细胞群的功能异常及其与黑素细胞的交互作用对白癜风的发病同样重要,充分而准确地了解不同病期白癜风皮肤全层细胞、组织的病理生理状态,对认识和治疗... 详细信息

白癜风发病机制复杂,黑素细胞缺失是核心。目前认为除黑素细胞自身缺陷外,表皮和真皮细胞群的功能异常及其与黑素细胞的交互作用对白癜风的发病同样重要,充分而准确地了解不同病期白癜风皮肤全层细胞、组织的病理生理状态,对认识和治疗白癜风有重要作用。本文旨在综述黑素细胞及相关细胞群在白癜风发病中作用的研究进展。

关键词：白癜风黑素细胞角蛋白细胞成纤维细胞 CD4阳性T淋巴细胞 CD8阳性T淋巴细胞记忆T细胞

芦荟苦素对色素化皮肤类似物模型中黑素细胞的影响

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中华整形外科杂志 2008年第1期24卷 50-53页

作者：杨壮群王正辉张铁良屠军波宋勇虎小毅李国光西安交通大学口腔医院口腔颌面整形外科 710004 宝鸡市口腔医院

目的观察芦荟苦素、熊果苷及茶多酚对色素化皮肤类似物模型中黑素细胞的影响。方法体外构建色素化皮肤类似物模型，检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对细胞形态、黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果在色素化皮肤... 详细信息

目的观察芦荟苦素、熊果苷及茶多酚对色素化皮肤类似物模型中黑素细胞的影响。方法体外构建色素化皮肤类似物模型，检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对细胞形态、黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果在色素化皮肤类似物模型中3种退色剂对黑素细胞酪氨酸酶活性有明显抑制作用，可显著减少黑素生成，其中以茶多酚的抑制作用最强，芦荟苦素次之。但茶多酚对细胞的毒性最大，熊果苷和芦荟苦素毒性均较小。结论3种退色剂对色素化皮肤类似物中黑素细胞的酪氨酸酶活性和黑素合成均呈浓度依赖性抑制，而茶多酚则显示出较大的细胞毒性（P〈0．05）。芦荟苦素所表现出的对酪氨酸酶和黑素的合成有较强的抑制作用及对细胞较低的毒性作用，有可能成为一种比较安全的退色剂。

关键词：黑素细胞芦荟苦素色素化皮肤类似物模型熊果苷茶多酚酪氨酸酶退色剂

黑素细胞单独移植与黑素细胞和角质形成细胞共培养混合移植治疗节段型白癜风临床疗效比较

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临床皮肤科杂志 2017年第9期46卷 620-625页

作者：吕静刘娟娟徐伟韩晓凤张洁戚东卫龚娟重庆市第一人民医院皮肤科重庆400011

目的:观察自体培养黑素细胞(MC)单独移植与MC和角质形成细胞(KC)共培养混合移植治疗节段型白癜风的临床疗效。方法:选择20例稳定期节段型白癜风患者,用负压吸疱法在白癜风患者正常皮肤区吸疱取皮,在相应的培养基中分别培养MC和KC,体外建... 详细信息

目的:观察自体培养黑素细胞(MC)单独移植与MC和角质形成细胞(KC)共培养混合移植治疗节段型白癜风的临床疗效。方法:选择20例稳定期节段型白癜风患者,用负压吸疱法在白癜风患者正常皮肤区吸疱取皮,在相应的培养基中分别培养MC和KC,体外建立MC和KC共培养模型。最后将MC悬液、MC和KC混合悬液分别用于移植治疗白癜风患者的皮损区,观察移植后色素生成效果,并进行临床疗效分析比较。结果:20例患者32个皮损区接受了移植治疗,移植1个月后皮损区出现明显的色素产生,4~5个月后所有皮损区均有色素再生,6~8个月后色素恢复稳定,颜色与周围正常皮肤接近,未见瘢痕和其他不良反应。MC单独移植治疗16个皮损区,有效率68.75%,痊愈率25%。MC和KC共培养混合移植治疗16个皮损区,有效率81.25%,痊愈率56.52%。两组间有效率与痊愈率比较差异均有统计学意义(P细胞培养移植方法治疗稳定期节段型白癜风疗效肯定,有治疗面积大、成功率高、用少量供皮区即可治疗大面积皮损等优点。MC和KC共培养混合移植治疗效果可能优于MC单独移植。

关键词：白癜风黑素细胞角质形成细胞共培养移植

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蓝光导致皮肤色素沉着的发生机制研究

日用化学工业（中英文） 2024年第1期54卷 90-94页

作者：刘峻辰孟宪瑶凌霄虞旦郭苗苗李丽北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验北京100048 北京尚捷优蓝科技有限公司北京100081

蓝光是一种波长为400~500 nm的可见光,其对人体主要危害有损伤眼周及眼部结构、加速皮肤老化、抑制褪黑素分泌、造成皮肤色素沉着等。当前,关于蓝光导致皮肤色素沉着的研究较少,文章首次系统地整理了蓝光导致皮肤色素沉着的发生机制,其... 详细信息

蓝光是一种波长为400~500 nm的可见光,其对人体主要危害有损伤眼周及眼部结构、加速皮肤老化、抑制褪黑素分泌、造成皮肤色素沉着等。当前,关于蓝光导致皮肤色素沉着的研究较少,文章首次系统地整理了蓝光导致皮肤色素沉着的发生机制,其主要包含蓝光对视蛋白3、α-MSH-MC1R通路、黑皮素受体、细胞因子等产生影响最后导致黑素生成增加,引发皮肤色素沉着。为后续相关研究提供了思路与理论基础。

关键词：蓝光黑素细胞视蛋白黑皮素受体色素沉着